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弧菌分离培养基的使用注意事项有哪些?体现在哪些方面?

2026-02-13 14:07阅读:
弧菌分离培养基的使用注意事项有哪些?体现在哪些方面?





弧菌分离培养基的使用需严格把控配制、灭菌、接种、培养及生物安全等关键环节,核心是确保培养基有效性和操作安全性,避免污染或漏检。

一、培养基配制与灭菌注意事项

1、成分精准称量与溶解

需严格按配方比例称量各成分,尤其是氯化钠、胆盐、抑菌剂等关键成分,其浓度直接影响弧菌选择性(如高盐环境是弧菌生长的必要条件)。

溶解时建议用纯化水或蒸馏水,加热过程中需不断搅拌,避免成分沉淀,确保所有成分完全溶解后再校正 pH。

2、pH 值严格校正

多数弧菌(如霍乱弧菌)偏好碱性环境,培养基 pH 需精准控制在8.4-8.6(如碱性琼脂、庆大霉素琼脂)。若 pH 偏低,可能抑制弧菌生长;pH 过高则会导致非目标菌过度繁殖。

校正 pH 时需在培养基冷却至 40-50时进行,避免高温下 pH 计探头损坏,且校正后需搅拌均匀。

3、灭菌条件规范

常规采用121高压蒸汽灭菌 15-20 分钟,灭菌时间和温度需严格把控:时间过短可能导致灭菌不彻底,引入杂菌;时间过长或温度过高,会破坏培养基中的营养成分(如酵母粉、蛋白胨)和抑菌剂活性。

含抑菌剂或显色剂的培养基,需在灭菌后冷却至 50-55 时再加入,避免高温破坏药效或显色效果,加入后需迅速摇匀并倾注平板。

二、平板制备与储存注意事项

1、平板倾注与凝固

灭菌后的培养基需趁热倾注(避免凝固),每个平板倾注量控制在15-20ml,确保厚度均匀(过薄易干裂,过厚影响菌落生长)。

倾注时需避免产生气泡,若有气泡可轻轻刮除;凝固过程中需保持平板水平,防止培养基厚薄不均,凝固后需倒置放置(避免冷凝水滴落污染表面)。

2、储存条件与有效期

制备好的平板需密封后置于2-8冰箱避光储存,不同培养基有效期不同:TCBS 琼脂、弧菌显色培养基建议 7 天内使用,碱性琼脂可延长至 14 天。

储存期间需定期检查:若平板出现干裂、霉斑、颜色异常(如 TCBS 琼脂由绿色变为黄色),或表面有冷凝水过多的情况,需立即丢弃,不可使用。

三、样本接种与培养注意事项

1、样本处理与接种方法

样本(如粪便、水产品、水体)需新鲜处理,若不能立即接种,需置于无菌容器中冷藏(2-8),且冷藏时间不超过 24 小时,避免弧菌失活。

接种时需采用分区划线法(从高浓度到低浓度逐步稀释),确保形成单菌落,便于后续鉴定;划线工具(如接种环)需灼烧灭菌并冷却后使用,避免高温杀死样本中的弧菌。

2、培养环境严格控制

弧菌为需氧或兼性厌氧菌,需在35-37有氧环境(如普通培养箱)中培养,培养时间根据培养基类型调整:TCBS 琼脂需 18-24 小时,碱性胆盐琼脂需 16-18 小时,不可过长(避免菌落过度生长融合,影响观察)。

部分弧菌(如副溶血性弧菌)需高盐环境,培养过程中需确保培养基中的盐分不流失(如培养箱内避免过度干燥),否则可能导致菌落生长不良。

四、结果观察与生物安全注意事项

1、菌落观察与鉴别

培养后需根据培养基特性判断目标菌落:如 TCBS 琼脂上,霍乱弧菌为黄色菌落,副溶血性弧菌为绿色菌落;弧菌显色培养基上,副溶血性弧菌为品红色菌落。需排除杂菌干扰(如大肠菌群在 TCBS 琼脂上不生长或生长微弱)。

若未观察到目标菌落,需排查原因:样本是否新鲜、培养基是否失效、培养条件是否正确,必要时重新接种。

2、生物安全严格把控

弧菌(尤其是霍乱弧菌)属于致病性微生物,操作需在生物安全二级(BSL-2)实验室进行,操作人员需穿戴防护服、手套、口罩,避免样本接触皮肤或吸入气溶胶。

实验结束后,所有污染的器具(如接种环、培养皿)需经121高压灭菌 30 分钟后再清洗或丢弃;实验台面需用含氯消毒剂擦拭消毒,避免交叉污染。

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