沙门氏菌生化鉴定方法的核心原理及操作流程与步骤！

2026-02-26 14:36阅读：

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沙门氏菌生化鉴定方法的核心原理及操作流程与步骤！

沙门氏菌的生化鉴定是微生物学实验室中确认该属细菌的关键步骤。生化鉴定条和成套生化鉴定管（如常规的微量发酵管组合）都是基于沙门氏菌特定的生化反应模式来设计的。以下是它们使用的一般步骤和要点：

一、核心原理：

通过观察沙门氏菌对多种碳水化合物（糖、醇类）的发酵能力、酶的产生以及其他特定的代谢反应，形成独特的生化反应谱，与已知的沙门氏菌生化模式或数据库进行比对，从而鉴定到属（有时到种或血清型）。

二、通用使用步骤：

1、前期准备：

纯培养物：必须使用纯培养的、新鲜（通常18-24小时培养）的疑似沙门氏菌菌落。通常来自选择性平板上的典型菌落（无色透明、中心黑色或全黑）。

菌悬液制

备：

鉴定条（API 20E等）：严格按照说明书要求，用无菌生理盐水或专用悬浮液制备一定浊度（通常是0.5麦氏浊度）的均一菌悬液。浊度直接影响接种量。

成套鉴定管：通常需要制备较浓的菌悬液（如几个菌落混悬于少量无菌生理盐水中），用于液体培养基的接种或固体培养基的穿刺/划线。

试剂准备：准备好鉴定条或鉴定管所需的附加试剂，并确认在有效期内。

标签：清晰标记所有鉴定条或鉴定管，包括样品编号、日期等。

生物安全：在生物安全柜中操作，遵守二级生物安全防护标准，穿戴个人防护装备。

2、接种：

鉴定条（API 20E）：

将菌悬液小心加入鉴定条的反应杯（小管）中，充满杯体和下方的小管（形成“凸月面”）。

对于需要厌氧环境的测试杯，在加入菌悬液后，需立即加入无菌石蜡油封盖，创造厌氧环境。

成套生化鉴定管：

液体培养基（糖发酵管、蛋白胨水等）：用无菌接种环或滴管吸取菌悬液，接种到每管液体培养基中。对于需要观察产气的糖发酵管，要避免气泡残留影响观察。

半固体培养基（动力、尿素酶等）：用无菌接种针进行穿刺接种。

固体斜面培养基（枸橼酸盐等）：用无菌接种针进行划线接种。

3、培养：

温度：通常置于35-37°C恒温培养箱中。

时间：18-24小时是标准培养时间。有些反应可能需要在培养后立即观察，有些反应需要培养后再添加试剂观察。

湿度：对于鉴定条，通常需要放在有湿盒的培养盒中培养，防止培养基干燥。

4、添加试剂 & 结果判读（培养后）：

鉴定条（API 20E）：

培养后，根据说明书要求添加特定试剂：

TDA试验：加入TDA试剂（三氯化铁溶液），观察颜色变化（红棕色为阳性）。

IND试验（吲哚）：加入Kovac's试剂，观察表面颜色（红色环为阳性）。

VP试验：加入VP-I和VP-II试剂，等待10分钟，观察（红色为阳性）。

GLU（葡萄糖发酵产气）：观察杯内小管是否有气泡聚集（有气泡为阳性）。

其他反应通常根据培养后的颜色变化、黑色沉淀（HS）或生长情况直接判读。

成套生化鉴定管：

糖醇发酵管：观察颜色变化（通常由紫变黄表示产酸）和杜氏小管中是否有气泡（产气）。注意：沙门氏菌通常发酵葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌除外，仅产酸不产气），不发酵乳糖和蔗糖（保持紫色）。

HS试验（如TSI或SIM或单独的醋酸铅纸条）：观察是否有黑色沉淀物产生（阳性）。

吲哚试验：加入Kovac's试剂，摇匀，静置，观察上层是否出现玫瑰红色环（阳性）。

MR试验：加入甲基红试剂，观察是否变红色（阳性）。

VP试验：加入VP试剂甲液和乙液，摇匀，静置10-30分钟，观察是否变红色（阳性）。

枸橼酸盐利用试验：观察斜面是否有菌苔生长且培养基由绿色变为蓝色（阳性）。

尿素酶试验：观察培养基是否由黄色变为粉红色或红色（阳性）。

动力试验：观察穿刺线周围培养基是否变浑浊（云雾状扩散），穿刺线清晰为无动力（阴性）。

赖氨酸脱羧酶/鸟氨酸脱羧酶试验：观察是否由黄色变为紫色（阳性），黄色为阴性（仅发酵葡萄糖产酸）。保持紫色或变黄后转紫也是阳性。

ONPG试验：加入ONPG试剂（或使用预加试剂管），培养或水浴后观察是否变黄色（阳性，表明有β-半乳糖苷酶）。

氧化酶试验：用氧化酶试纸或试剂滴加在菌苔上，观察是否在10-30秒内变深紫色（阳性）。沙门氏菌应为氧化酶阴性。

硝酸盐还原试验：加入硝酸盐还原试剂A和B，观察是否出现红色（阳性，表示还原为亚硝酸盐）。如不显色，需加锌粉检查是否出现红色（不显红为阳性，表示还原超过亚硝酸盐阶段）。

5、结果分析与报告：

鉴定条（API 20E）：根据每个测试的阳性（+）或阴性（-）结果，得到一个7位或9位的数字谱（Profile Number）。查阅配套的API数据库手册或使用软件，输入数字谱，即可得到鉴定结果（通常是属和种）及可信度（%ID和T值）。

成套生化鉴定管：将每个生化反应的结果（+/-）与沙门氏菌的典型生化反应模式进行比对。典型的沙门氏菌（非伤寒）生化特征包括：

葡萄糖产酸产气（+AG，但伤寒沙门菌不产气）

不发酵乳糖（-）

不发酵蔗糖（-）

产生HS（+，但有些血清型如甲型副伤寒沙门菌可能弱阳性或阴性）

吲哚阴性（-）

MR阳性（+）

VP阴性（-）

枸橼酸盐利用通常阳性（+，但伤寒沙门菌和部分鸡白痢/鸡伤寒沙门菌阴性）

尿素酶阴性（-）

赖氨酸脱羧酶阳性（+，关键指标，极少数例外）

鸟氨酸脱羧酶通常阳性（+）

动力通常阳性（+，但鸡白痢和鸡伤寒沙门菌无动力）

ONPG阴性（-，表明无β-半乳糖苷酶，迟缓发酵乳糖）

氧化酶阴性（-）

硝酸盐还原阳性（+）

报告：如果生化反应模式与沙门氏菌典型特征相符（特别是关键指标如赖氨酸脱羧酶阳性、HS阳性、不发酵乳糖蔗糖、尿素酶阴性、氧化酶阴性），则可报告为“检出沙门氏菌属”。进一步的血清学分型是确定具体血清型所必需的。如果模式不典型，需考虑是否为变异株或其他菌属，并可能需要进一步试验或使用更精确的方法（如分子生物学方法）。

关键注意事项：

纯度：非纯培养物会导致结果混乱或错误。

菌龄：过老或过幼的培养物可能影响反应活性。

接种量：严格按照要求（特别是鉴定条），过多或过少都会影响结果。

培养条件：温度和时间必须准确控制。

试剂：使用新鲜、有效的试剂，严格按照步骤和时机添加。

判读标准：熟练掌握各生化反应的阳性、阴性判定标准，注意细微差别（如颜色深浅、沉淀程度）。

质控：定期使用标准菌株（如大肠埃希菌ATCC 25922 - 阴性对照，鼠伤寒沙门菌ATCC 14028 - 阳性对照）进行质量控制，验证试剂和方法的有效性。

安全：始终遵守生物安全操作规程。

记录：详细记录所有操作步骤、培养条件和结果。

局限性：生化鉴定对典型沙门氏菌效果好，但对生化不典型或罕见的变异株可能鉴定困难或错误。血清学确认是最终鉴定沙门氏菌血清型的金标准。分子生物学方法也越来越常用作快速筛查或确认。

总结：

生化鉴定条提供标准化、微量化和数据库辅助判读的优势。成套生化鉴定管则更灵活，可以根据需要组合，成本相对较低，但操作步骤稍多，结果判读依赖人员经验。无论使用哪种方法，理解沙门氏菌的典型生化特性、严格遵守操作规程、准确判读结果并进行必要的质控和确认（血清学/分子），是保证鉴定结果准确可靠的关键。

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