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环境中微生物检测和分离纯化实验的核心原理与操作步骤!

2026-02-26 14:43阅读:
环境中微生物检测和分离纯化实验的核心原理与操作步骤!



百欧博伟生物:环境中微生物的检测和分离纯化实验,核心是通过取样、培养、分离、纯化四个关键步骤,从土壤、水、空气等环境样本中捕捉微生物,并获得单一菌种,为后续鉴定和研究奠定基础。

一、实验核心原理

环境中存在大量肉眼不可见的微生物(细菌、真菌等),它们因种类不同,对营养、温度、氧气的需求存在差异。实验正是利用这一特性:

选择性培养:使用特定培养基(如牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌,马铃薯葡萄糖培养基培养真菌),让目标微生物快速繁殖,抑制其他杂菌。

单菌落分离:微生物在固体培养基上繁殖时,单个菌体或孢子会形成肉眼可见的“单菌落”,每个单菌落理论上由一种微生物组成,这是纯化的关键依据。

二、实验材料准备

环境中微生物检测和分离纯化实验的核心原理与操作步骤!


三、详细实验步骤(以土壤样本为例)

1、样本稀释(避免菌落重叠,便于计数和分离)

称取 10g 土壤样本,放入装有 90mL 无菌水的锥形瓶中,振荡 30 分钟(使微生物充分分散),得到10¹ 稀释液。

用无菌移液器吸取 1mL 10¹ 稀释液,注入装有 9mL 无菌水的离心管中,混匀后得到10² 稀释液。

重复上述操作,依次制备10³、10、10 稀释液(根据土壤污染程度调整,一般选 10³~10三个梯度)。

2、涂布接种(将微生物均匀接种到培养基上)

取无菌培养皿,在皿底贴好标签,注明样本类型、稀释度、日期。

用无菌移液器吸取 0.1mL 某一稀释度的菌液,滴在对应的固体培养基中央。

点燃酒精灯,将涂布棒在火焰上灼烧灭菌(冷却 30 秒,避免烫死微生物),然后在培养基表面轻轻涂布,使菌液均匀分布。

每个稀释度做 3 个重复(减少误差),同时设置“空白对照”(只加 0.1mL 无菌水,检测培养基是否污染)。

3、恒温培养(提供适宜环境,让微生物繁殖)

细菌培养:将接种好的牛肉膏蛋白胨培养基放入 37恒温培养箱,倒置培养 18-24 小时(倒置可防止冷凝水滴落污染菌落)。

真菌培养:将马铃薯葡萄糖培养基放入 28恒温培养箱,倒置培养 3-5 天(真菌生长速度慢于细菌)。

4、菌落观察与计数(初步检测微生物数量)

培养结束后,观察平板上的菌落形态:

细菌菌落:通常较小,表面光滑或粗糙,颜色多为白色、黄色。

真菌菌落:较大,呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状,颜色多样(如绿色、黑色、红色)。

选择菌落数在 30-300 之间的平板(计数最准确),统计每个平板的菌落数,按公式计算每克土壤中的微生物数量:

微生物数量(CFU/g)= 平板平均菌落数 × 稀释倍数 / 接种菌液体积(0.1mL)

5、分离纯化(获得单一菌种)

用接种环在酒精灯火焰上灭菌,冷却后挑取平板上形态不同的单菌落(挑取时尽量只取菌落边缘,避免杂菌污染)。

将挑取的菌落划线接种到新的固体培养基上(划线方法:先划一条直线,转动平板 45°,从第一条线末端开始划第二条线,重复 3-4 次,使菌体逐渐稀释)。

再次放入对应温度的培养箱中培养,待长出单菌落后,重复划线 1-2 次,直至平板上所有菌落形态完全一致,即获得纯化的菌种。

四、关键注意事项(避免实验失败的核心)

无菌操作贯穿全程:所有工具(接种环、涂布棒、移液器)需灭菌,操作时靠近酒精灯火焰(利用火焰形成的无菌区),避免手或空气直接接触培养基和菌液。

稀释梯度选择合理:若稀释度过高,平板上菌落太少(<30),计数误差大;稀释度过低,菌落重叠(>300),无法准确计数。

划线纯化技巧:每次划线前接种环需重新灭菌,且后一次划线要与前一次划线末端交叉,确保菌体逐步稀释,最终形成单菌落。

培养温度和时间准确:细菌和真菌的最适温度不同,培养时间过短菌落未长出,过长则菌落过度繁殖导致重叠。

五、实验结果与分析

结果记录:绘制“菌落形态记录表”,记录不同样本(如土壤、水、空气)的菌落数量、颜色、形状、大小。

常见问题分析:

平板无菌落:可能是稀释过度、接种时菌液流失、培养基灭菌不彻底(对照平板也无菌落可排除此问题)。

菌落形态混杂:纯化不彻底,需重新挑取单菌落划线。

对照平板有菌落:培养基或无菌水被污染,实验需重做。

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