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兔内皮祖细胞的分离培养与鉴定方法及注意事项有哪些?

2026-05-09 14:58阅读:
兔内皮祖细胞的分离培养与鉴定方法及注意事项有哪些?





兔内皮祖细胞是从兔体内分离的血管内皮前体细胞,具有增殖、迁移及分化为成熟内皮细胞的能力,是心血管、缺血损伤修复、血管再生研究的核心细胞模型。

一、基本特性

来源:主要为骨髓、外周血、脾脏。

形态:

早期:圆形/类圆形

培养 48–72 小时:贴壁、短梭形/纺锤形

7 天左右:呈铺路石样内皮形态

标志物:

祖细胞:CD133、CD34

内皮系:CD31、vWF(VIII 因子)、VEGFR2(KDR)

功能:
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体外可形成管腔样结构

能吞噬 Dil-acLDL、结合 FITC-UEA-1

分泌VEGF、bFGF等促血管因子

二、分离与培养(骨髓来源,常用)

1、取材

麻醉兔,取股骨/胫骨骨髓,用肝素化 PBS 冲洗

密度梯度离心

骨髓液叠加于Ficoll-Paque(1.077 g/mL)

2000 rpm 离心 20 min,收白膜层单个核细胞

2、接种与培养

培养基:ECM/EGM-2 + 10% FBS + VEGF + bFGF + 双抗

接种于纤连蛋白(FN)包被的培养瓶

37、5% CO培养;3 天半换液,7 天传代

3、传代

0.25% 胰酶 - EDTA 消化,1:2 传代

建议用P2–P4 代做实验

三、鉴定方法

形态:7 天呈梭形、铺路石样

免疫荧光/流式:

阳性:CD34、CD133、CD31、vWF、VEGFR2

双荧光吞噬:

Dil-acLDL(红)+ FITC-UEA-1(绿)双染阳性 >80%

体外成管:基质胶上6–12 小时形成管状结构

四、主要应用

1、心血管疾病

心肌梗死模型:移植 EPCs 提升LVEF、增加毛细血管密度

2、缺血性疾病

下肢缺血、脑缺血:促进血管新生、改善血供

3、血管损伤修复

球囊损伤后再狭窄:抑制内膜增生、保护内皮

4、急性肺损伤

归巢至肺损伤部位,修复内皮、减轻肺水肿、抗炎

糖尿病血管病变、伤口愈合

五、注意事项

纯度:原代含杂细胞,P2–P3较纯

代次:P4 后分化能力下降、易衰老

污染:骨髓/血液易带菌,严格无菌、加双抗

培养基:必须含VEGF、bFGF维持干性

六、与人类 EPCs 对比

优势:兔血管结构、生理与人接近,造模稳定、伦理限制少

局限:标志物与人略有差异,试剂抗体选择有限

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