实验四 薄层色谱
2007-03-04 14:47阅读：
一、实验目的
学习和掌握薄层色谱法分离有机化合物的基本原理和实验技术。
二、基本原理
薄层色谱法
(TLC)是把吸附剂或支持剂铺在玻璃板上，将样品点在其上，然后用溶剂展开，使样品中各个组分相互分离的方法。这是一种简便、快速、微量的分离分析技术，其应用范围非常广泛。
根据分离原理的不同，TLC可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱和离子交换薄层色谱等。
对于吸附薄层色谱来说,被分离物质的分子同时受到吸附剂的吸附和溶剂的溶解作用。由于混合物中不同物质与吸附剂
(固定相)之间的吸附力不同和不同物质在溶剂(流动相)中的溶解度不同，因此，当这种吸附和溶解
(解吸)达到平衡时，不同的物质在固定相和流动相之间便具有不同的质量分配比或平衡常数
(K)。随着固定相和流动相的连续不断地相对移动,物质在固定相和流动相之间的平衡状态将会不断地被打破和重新建立,物质也因此而随着流动相的运动而移动。那些与吸附剂吸附力小，在流动相中溶解度大的物质将移动的较快,相反,那些与吸附剂吸附力较大，在流动相中溶解度较小的物质则移动的较慢。这样,不同的物质便由于其移动速度的不同而得到分离。
物质在薄层板上移动速度常用
Rf值 (比移值)表示，其定义是:
影响Rf值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂的种类、粒度、活度
(吸附能力)，展开剂的纯度、组成及挥发性，展开方式
(上行或下行)，层析缸的形状、大小及饱和程度,外界温度等。但是，在固定的条件下,某化合物的Rf值是一个常数。因此，在条件完全相同的情况下，Rf值可以作为鉴定和检出该化合物的指标，就像测定熔点或其它物理常数一样。为了获得相同的色谱条件，通常是把未知样和标准样同时滴加在同一块薄板上。
1．吸附剂和支持剂
吸附色谱中最常用的吸附剂有硅胶和氧化铝，粒度一般为
15O-300目筛孔，其次是聚酰胺和纤维素，其粒度一般分别为70-140目筛孔和160-200目筛孔。氧化铝的极性比硅胶大，比较适用于分离极性较小的化合物(烃、醚、醛、酮、卤代烃等)，因为极性化合物被氧化铝较强烈地吸附，分离较差，Rf值较小。相反，硅胶适用于分离极性较大的化合物
(羧酸、醇、胺等)，而非极性化合物在硅胶板上吸附较弱，分离较差，Rf值较大。
当给一些吸附剂的表面负载上特殊的固定液时，吸附剂便成为分配色谱中的支持剂。常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素等。常用固定相是水、甲酰胺、石蜡油和纤维素等。
2. 展开剂及其选择
选择展开剂一般需要针对吸附剂的种类、活度和被分离混合物的组成及各成分的性质的具体情况而定。一般的原则是，被分离物质和展开剂之间的极性关系应符合“相似相溶原理”，也就是说，被分离物质的极性较小，展开剂的极性也就较小，被分离物质的极性较大，展开剂的极性也就较大。在确定出展开剂的大致范围之后，可以通过实际的薄层试验进行筛选和最后确定。比较简单的试验方法之一是微圆环技术。
常用溶剂作为展开剂的极性大小顺序为:
石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜乙酸甲酯＜丙酮＜正丙醇＜甲醇＜吡啶＜酸
在更多的情况下，是很难以找到理想的单一溶剂的展开剂。此时，常用两种或两种以上的混合溶剂作为展开剂。下列是一些常用混合溶剂的极性顺序:
苯:氯仿 ( 1:l, V/V 下同)＜环己烷:乙酸乙酯 (8:2)＜氯仿:丙酮 (95:5)＜苯:丙酮
(9:1)＜ 苯:乙酸乙酯(8:2)＜氯仿:乙醚
(9:1)＜苯:甲醇(95:5)＜苯:乙醚（6:4）＜环己烷:乙酸乙酯（1:1）＜氯仿:乙醚(8:2)＜氯仿:甲醇(99:1)＜苯:甲醇(9:1)＜氯仿:丙酮(85:15)＜苯:乙醚
(4:6)＜苯:乙酸乙酯 (1:1)＜氯仿:甲醇 (95:5)＜氯仿:丙酮
(7:3)＜苯:乙酸乙酯(3:7)＜苯:乙醚(1:9)＜乙醚:甲醇(99:1)＜乙酸乙酯:甲醇(99:1)＜苯:丙酮
(1:1)＜氯仿:甲醇:(9:1)。
三、实验仪器及药品
仪器：
玻璃棒、玻璃板（5*11）、研钵、小锥形瓶（具塞）、滴管、分液漏斗、点样毛细管、展析缸（标本缸）、尺子。
药品：
硅胶G、菠菜、氯化钠、展开剂（石油醚：乙酸乙酯=3:2）、提取剂（石油醚：乙醇=2：1）、无水硫酸钠、蒸馏水。
四、操作步骤
1、薄层板的制备
将两块玻璃板洗净，用蒸馏水洗后烘干，再用酒精棉球擦去手印，表面光禁无瘢痕。
称取3g硅胶G（有硅胶+13%CaSO4)于研钵中，加约7.5ml蒸馏水，立即冲粉调成均匀的糊状，分到在两块备好的玻璃板上，迅速用玻璃棒徒步整块板面，然后拿住玻璃板的一端在桌边轻轻摇振，并要求表面光滑。涂好的玻璃板方置于水平桌面上晾干表面大水分（约30min），再放入105度烘箱中活化30min，取出后冷却，在一端距边1cm处轻轻划出标记（在边缘画出刻痕，不可在表面划线），另一端，距边1.5cm处画出标记。完成后备用。
2、叶绿素的提取
在研钵中放入几片（约6g）菠菜叶，加入10ml提取液，轻轻按压，不可研成糊状。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加入10ml饱和氯化钠溶液（防止生成乳浊液）除去水溶性物质，分去水层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加入2g无水硫酸钠干燥。干燥后的液体倾倒至另一锥形瓶中（如颜色浅，可适当挥发浓缩）。
3、点样
用一根直径1mm毛细管，吸取适量提取液，轻轻的点在距薄板一端1.5cm处，平行点两点，两点相距1cm左右（每点点样30次以上，不可点破）。点样斑点不可超过2mm。
4展开
在干燥的展析缸中加入约10ml的展开剂，盖好盖子，摇动，使其为容积正气所饱和。将电好样品的薄板用点样一端向下倾斜至于展析缸中（无视样品斑点进入展开剂），盖好盖子。当溶剂湿润的前沿上升至距板的上端约1cm时，取出薄板晾干。此时由下到上依次会看到：三个黄色斑点为叶黄素，蓝绿色斑点为叶绿素A，绿色斑点为叶绿素B，灰色斑点为脱镁叶绿素，两个桔黄色斑点为胡萝卜素，共8个半点。
5、计算Rf值
五、操作要点
1、制备薄板板面要平整均匀，划标记线时，不可横穿板面。
2、提取叶绿素时，不要过度研磨，以防出现混浊液，难以分离。
3、点样时，位置要均匀，不要戳破板面，斑点直径不要过大，少量多次。
4、展开时避免湿润的前沿超过上刻度线。
六、实验成败关键
铺板要均匀，叶绿素提取不可混浊
