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SDS电泳中浓缩胶的压缩原理

2010-07-22 10:52阅读:
我们在SDS电泳中有时会遇到样品在浓缩胶里面形成弥散,没有达到压缩的目的导致实验失败,因此我们需要了解浓缩胶压缩样品蛋白的原理,从而避免下一次失败。
在不连续电泳中,样品在含有高于它的pH缓冲液中进行电泳。此时样品以负离子形式存在,它在浓缩胶中(pH略低于样品)被高度浓缩呈薄层而实现提高分辨率的目的。
例如:待分离样品是血清蛋白,浓缩胶用Ph6.7的Tris-HCl Buffer 配制,电泳Buffer用ph8.3的Tris-甘氨酸,配制。
电泳开始以后,我们待分离的样品蛋白在进入pH6.7的浓缩胶中,在电场和电泳Buffer的共同作用下解离成负离子向正极泳动。同时电泳Buffer中的甘氨酸,因为其等电点为6.0所以在此过程中只有少部分解离(0.1-1%)成负离子向正极泳动。同时浓缩胶中的HCl解离度最大,几乎全部释放出氯离子向正极泳动。
根据电泳有效泳动率的公式;解离度(α)与泳动率(m)的乘积等于有效泳动率(mα)。在本次不连续电泳体系中,氯离子的有效泳动率最大称为快离子,甘氨酸电离出的负离子有效泳动率最小称为慢离子,而样品中的各种成分蛋白质的有效泳动率则介于快、慢离子之间。
因此在电泳开始的时候,快离子快速向正极泳动,慢离子和样品蛋白离子泳动滞后,因此在快离子后面形成一条离子浓度较低的低电导区域。由于电导与电势梯度成反比,因此在此区域产生了较高的电势梯度,由于泳动率(m)与电势梯度呈正比,使得慢离子和样品离子根据其α的大小,有序的加速向快离子靠拢,最后在进入分离胶的时候形成我们通常见到的压缩现象。
所以,压缩现象不能形成的主要原因是:
一、缺乏快离子,浓缩胶中的Buffer 失效。
二、缺乏慢离子,电泳Buffer 的pH 不适当。
三、电泳样品上样量过大,超过浓缩胶中Buffer的缓冲容量。

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