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在激光共聚焦显微镜，荧光团共存

2013-08-16 16:59阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/2739484597

乘法荧光标记标本在检查过程中，数字记录，两个或两个以上的发射信号往往可以重叠在最终图像中，由于其靠近内的微观结构。这种效应被称为共存，通常发生在荧光标记分子结合到目标在于非常接近或相同的空间位置。具有高度特异性的现代化合成荧光和古典免疫技术的应用已显着提高，加上精密光学部分和数字图像处理共聚焦和多光子显微镜所提供的马力，能够检测生物样品中的共存。
在激光共聚焦显微镜，荧光团共存
共定位，在生物表现，由驻留在同一物理位置的一个标本的两个或两个以上不同的分子的存在下定义。组织切片，单个细胞或亚细胞细胞器的显微镜观察的范围内，共定位可能表明这些分子是相同的受体，而在数字成像的上下文中，该术语是指通过荧光发射的颜色共享相同的图像中的像素的分子。在激光共聚焦显微镜，标本记录的数字图像，多维数组，包含许多量元素称为体素表示三维像素组成。
的目的，光照波长共焦检测器针孔直径的数值孔径，是由一个像素的大小（或检测体积）。因此，共存的两个荧光探针的Alexa Fluor 488的一个标本，如具有绿色发光和Cy3橙红色的发射，表示图像中的像素包含红色和绿色的贡献（通常是生产各种深浅不同的橙色和黄色）。
作为一个例子，在图1中示出的图像序列的共定位在细胞骨架蛋白，肌动蛋白，纽蛋白的蛋白质与粘着，粘附路口的横向光学平面（ - Ý轴用激光扫描共聚焦显微镜）。这些复合物作为成核点肌动蛋白丝和外部介质，质膜和肌动蛋白细胞骨架之间的交联剂。图1（a）是扫描收集过滤的Alexa Fluor 568（纽蛋白）的发射光谱的检测器，信道，用543纳米的氦氖激光激发时，而图1（b）是信道过滤，收集荧光在488纳米激发的氩离子激光的Alexa Fluor 488（丝状肌动蛋白）的排放量。数字组合的两个图像（图1（c））揭示了丝状肌动蛋白纤维的末端的两个荧光信号的共定位。
重要的是要注意，共定位并不是指相似的发射光谱的荧光基团的可能性将出现在合成图像中设置相同的像素。准确的共存分析的荧光发射光谱是唯一可能的，如果充分分离荧光团之间的和正确的过滤器集（或光谱狭缝宽度）的使用在收购序列。，如果光谱泄放通过工件的高度之间的荧光团的发射光谱，或由于使用不正确的过滤器组合的光谱重叠的，因为本，共​​定位测量将是没有意义的。为了避免工件，必须仔细匹配的荧光照明源（在共聚焦显微镜的激光线），同时仍保持一个有用的发射波长之间的分离程度，以获得最大的激励效率的功率谱。在大多数情况下，明智地选择荧光基团进行共定位分析获得令人满意的结果是最重要的。
在图2中，提出了一系列的Alexa Fluor染料组合是潜在有用的共定位实验光谱重叠比较。所有的发射光谱进行归一进行比较，而且，由灰色阴影表示的重叠区域。在图2（a）中，绿色荧光体的Alexa Fluor 488和橙黄色荧光的Alexa Fluor 555染料的发射光谱为表示明确分离的峰值波长，这也很容易被人眼区分。然而，中等水平的光谱重叠（灰色阴影区域）示出存在着相当大的Alexa Fluor 555（以黑线，从发光峰值到横轴表示发光波长峰值的Alexa Fluor 488的排放量） 。这种高层次的信号流血通过呈现分离的探头的情况下，很难的Alexa Fluor 488荧光信号强度明显大于的Alexa Fluor 555，这可能是由于一些因素，包括差异较大的荧光目标人群。其结果是，应避免这些探针的组合的共定位实验，或只用图像采集时，在multitracking共焦模式下，以减少或消除渗出。
在激光共聚焦显微镜，荧光团共存
Alexa Fluor探针的光谱之间的重叠发射最大值之间的带宽增加而减小，如在图2（b）所示。在这种情况下的Alexa Fluor 488和深红色荧光的Alexa Fluor 633的图图2（a）相比表现出显着降低的水平时的重叠。应产生良好的效果，以最小的流血通过在共定位实验中，两种染料对人的眼睛和光谱重叠的程度低，很容易分辨的，所提供的每个探针的浓度类似的（注意，深红色的Alexa Fluor 633的荧光可能是很难想象，通过在低浓度时，在显微镜目镜）。最有效的Alexa Fluor 633由633纳米线的一个红色氦 - 氖激光激发，但也可用于与594纳米线的一个黄色的氦氖激光。也许是最好的发射可见光的Alexa Fluor染料的光谱分离的Alexa Fluor 488的Alexa Fluor 647（图中未示出）的组合。几乎没有这些染料和流血，通过文物的光谱之间的重叠，应该是不存在的，即使是在标本中含有过量的Alexa Fluor 488。具有这些特征的荧光探针共存调查，配备适当的激光共聚焦显微镜的理想人选。
是有限的能力确定的共定位在共聚焦显微镜的光学系统的分辨率和用来照亮标本的光的波长。宽视场荧光和共焦显微镜的理论分辨率为约200纳米（0.2微米），但在实践中，这个数目下降到400和600纳米之间的值的原因有多种，包括未对准的显微镜，折射率波动，光学畸变，试样制备不当。然而，在几乎所有的情况下，一个完全调谐的激光共聚焦显微镜的光学分辨率极限是不足够的，以确定两个荧光分子是否被附加到一个单一的目标，或者他们是否驻留在相同的细胞器。许多实验方案的设计高度特异性的合成探针或抗体针对本地化和明确的蜂窝结构，很容易受到歧视的周围。其他产生标本与探头之间的重叠程度高的区域显示。
对于小于5微米的厚度，如粘附细胞或非常薄的组织切片的标本，共定位定量分析往往是可能在传统的宽视场荧光显微镜。然而，对于更厚的试样，图象应记录，可作为有限的轴向尺寸，以确定是否表面上共定位的荧光团的实际驻留在相同的横向焦平面或者他们是否在彼此沿显微镜的z轴垂直叠加的光学部分。应该由获得薄的光学部分，可以使用激光扫描或旋转盘共聚焦和多光子显微镜厚标本的荧光基团的共定位分析。多光子工具往往能激发一个单一的近红外激光光谱线的焦点目标高度定义的音量都荧光双标记标本。这种独特的功能限制只居住在焦平面，这大大降低了漂白文物和背景噪音的荧光基团的荧光发射。
软件共定位分析
标本中的荧光基团的共定位的程度的测量是通过比较等效所获取的图像的各像素位置中的颜色值。在分析过程中的第一个步骤涉及的图像显示在其上的共定位测量将被执行，无论是作为一个复合材料是来自于两个独立的信道单波长收购（优选的技术）或乘法标记的试样作为一个单一的图像获取。检查样品，具有两个以上的标签时，只有两个假色是在一个单一的计算处理，但是所有的伪彩色排列随后可以被选择作为对共定位分析。通常情况下，红 - 绿色对被选择用于共焦荧光由于传统使用的氩离子，氪，氩，氦 - 氖激光器，它能够有效地刺激强烈的蓝色和绿色区域的荧光团的吸收光谱线。此外，人眼更敏感的色调中的绿色和红色的
奥林巴斯显微镜
共定位分析的试样pseudocolored图像的图形显示，方便地表示一个散点图（有时也简称为fluorogram）的，该关联两个数据集之间的关系或关联。的散点图图形的一个伪彩色（或通道）的强度与另一种在图像中的每个像素，或选择的感兴趣区域，一个两维的直方图（见图3和图4）。一个信道（通常为绿色）是沿图表的x轴，而其他的（通常为红色）Ý轴强度的取值范围从0到255的横坐标和纵坐标上绘制。因此，合成图像的每一个像素，其特征在于由一对笛卡尔坐标系中的坐标出类拔萃的强度。的分布模式的分析所产生的强度对可识别的荧光基团的共定位，以及背景歧视，渗色，漂白，和缺乏各信道之间的登记。
在激光共聚焦显微镜，荧光团共存
图3示出了3个双通道共聚焦显微镜的光学部分的图像平面（pseudocolored红色和绿色），从试样具有不同程度的荧光基团的共定位，以及与它们对应的散点图。位于附近的散点图的原点（0,0）的像素在每个通道具有非常低的强度，而较亮的像素的距离越远，在整个图形中分散。在散点图相关的红色和绿色通道，纯红色和绿色像素往往集中轴附近的情节，而共定位像素，如果存在的话，会出现彩色的橙色和黄色的色调（取决于共存的程度），跌近中心（X = Y）和上右上角的散点图。
在图3中的标本，包括大鼠脑海马冠状厚款标示的Alexa Fluor 488（神经纤维）和Alexa Fluor公司568（胶质纤维酸性蛋白GFAP，图3（a））。在图3（b）所示，而兔肾上皮细胞（RK-13 ​​行）共同表达一个印度麂鹿皮肤成纤维细胞染色的Alexa Fluor 568针对纽的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（丝状肌动蛋白）荧光蛋白，红色荧光蛋白和EYFP，本地化到细胞核，图3（c）中所示。相关的散点图的正下方的检体的图像（例如，图3（d）是图3（a）的散点图），两个通道共定位的程度是由白色字母和数字表示在左下右下角的每散点图。请注意在图3（a）的共定位（只有一对夫妇％的两个通道）相对缺乏，逐步提高的程度的共定位在图3（b）和图3（c）中，设有约30％和85％的系数元。
由图4中显示的图像，这是使用印度麂成纤维细胞染色的Alexa Fluor 568（纽红色通道）和Alexa生成的序列散点图分析荧光共定位，利用共聚焦显微镜和售后成像程序制造商提供的典型的软件概述氟488（丝状肌动蛋白，绿色通道）。一个地区的利益分析散点图中，选择白色矩形图4（a）表示。此区域设置的阈值电平的信号，将包含在大多数共定位的软件程序所执行的分析。
概述感兴趣的区域的垂直和水平边缘应对准，以排除背景信号，这是聚沿x 和Ý轴的散点图。只有包括在所选择的区域的边界的像素所产生的信号进行分析，在估计的共定位。重叠在该样本中的像素区域，容易地转换成共定位二进制阈值掩膜（图4（b）），它可以被叠加在图像上（图图4（c））作为共定位地图的。在图4中的地图上示出的阈值部分（c）表示在白的共定位区域，但这种颜色可以很容易地与大多数软件应用程序改变为另一种颜色，产生更高程度的对比，相对于原来的假色。
在激光共聚焦显微镜，荧光团共存
正如上面所讨论的荧光共定位，定量评估，可以得到共焦光学部分使用散点图和选定地区的利益获得的信息。几个值的生成使用从整个散点图的信息，而另一些则是来自于一个选定的感兴趣区域内包含的像素值。其中的变量来分析整个散点图的Pearson相关系数（ŗ（R） ），是其中一个应用在模式识别匹配的一个图像到另一个为了描述两种模式之间的重叠度的标准技术。Pearson相关系数的计算方法，根据公式：
在激光共聚焦显微镜，荧光团共存 （1）
其中，S1是在第一通道中的像素的信号强度，S2是在所述第二通道中的像素的信号强度。数值S1和S2 （平均）（平均）是第一和第二通道中的像素的平均值分别。Pearson相关性，从 ​​原来的亮度值的平均像素强度值中减去。作为一个结果，这个系数的取值范围从-1到1的值，值为-1表示完全缺乏对从图像中的像素之间的重叠，和一个值为1表示完美的图像配准。Pearson相关系

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