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实验室和工艺研发用切向流过滤技术简介

2013-11-04 16:53阅读：

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实验室和工艺研发用切向流过滤技术简介

简介

切向流过滤（TFF）是对生物分子进行快速、高效分离和纯化的技术，可广泛应用于免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学及微生物学等生物学领域。TFF可对10ml至数千升体积的样品进行浓缩和脱盐，也可以用于分离尺寸不同的生物分子、收获细胞悬液、净化发酵液和细胞裂解液。本文将简单介绍TFF的基本原理及其在实验室和工艺研发中的应用。

为什么要使用切向流过滤？

1. TFF设置、使用简单——通过软管和接头将TFF装置简单地连接到泵及压力监测设备，再将样品加载到容器，即可进行操作。
2. TFF快速、高效——相比透析，TFF设置更加简单，也更快速。而与离心相比，TFF
可在更短的时间内达到更高的样品浓度。
3. 可在单个系统内实现两步操作——可在同一个系统内对样品进行浓缩和洗滤，既节省时间，也可避免样品损耗。
4. TFF可规模放大或缩小——TFF装置和流路构建可根据需要进行规模调整，处理样品体积低可至10ml，高可达数千升。
5. TFF非常经济——TFF装置和流路可清洗并重复使用，也可单次使用后作抛弃型处理。可进行简单地完整性测试，以确认组件及密封完好。

切向流过滤能做什么？

1. 蛋白质和多肽浓缩、脱盐
2. 核酸（DNA/RNA/管核苷酸）浓缩、脱盐
3. 从细胞培养液中回收、纯化抗体或重组蛋白
4. 从细胞裂解液中回收、纯化质粒DNA或从全血中回收染色体DNA
5. 分馏稀释蛋白质混合液
6. 细胞裂解液或组织匀浆净化
7. 水、缓冲液及注射剂除热源（去除内毒素）
8. 柱层析样品制备
9. 细胞收获
10. 病毒回收或清除

KR2i 系统包括进行TFF设置和运行所需的所有硬件、软管和接头，只需简单地连接，即可对样品进行高效浓缩或洗滤。

切向流过滤简介

什么是切向流过滤？

膜过滤是生命科学实验室广泛使用的分离技术，根据膜的孔隙度，可以分为微滤和超滤。微滤膜孔径一般在0.1μm-10μm之间，常用于澄清、灭菌、微粒的去除以及细胞收获。超滤膜的孔径一般在0.001-0.1μm之间，常用于可溶性分子（包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物及其它生物分子）的脱盐和浓缩、缓冲液置换以及分馏操作，超滤膜的规格一般采用截留分子量（MWCO）来区分。

微滤和超滤都有两种主要的过滤模式：1）直流过滤（DFF），也称为“死端”过滤，进样液流垂直于膜表面，液体100%通过膜；2）切向流过滤（TFF），也称为错流过滤，进样液流平行于膜表面，部分料液通过膜（滤液），其余料液（回流液）循环回到进样容器。在DFF中，随着过滤的进行，大分子逐渐聚集在膜表面，并堵塞膜孔，降低过滤通量，即使增加压力，也只能将聚积层压紧，而不能改善过滤状态。在TFF中，沿膜表面流动的料液会将膜表面由于浓差极化而形成的凝胶层“扫掠”清除，从而维持膜的过滤状态，保证小分子通过。所以，相比DFF，TFF更加快速、高效。

直流过滤过程
A) 进样液流直接通过膜。比膜孔大的分子聚积在膜表面，形成凝胶，阻碍液流通过。
B) 随着过滤体积的增加，凝胶层逐渐增厚，流速迅速降低。

切向流过滤过程
A) 样品溶液从进样通道进入，沿膜表面流动通过。错流模式可防止分子在膜表面聚积而造成堵塞
B) TFF可减缓过滤流速的衰减，显著提高单位膜表面积的样品处理量。

应用

TFF的主要应用包括浓缩、洗滤（脱盐和缓冲液置换）以及不同规格生物分子的分馏。此外，TFF也可用于澄清或从发酵液或细胞培养液中清除细胞及细胞碎片。

浓缩

浓缩是指从溶液中去除液体而保留溶质分子的简单过程。溶质浓缩的程度与溶液体积的降低呈正比，如体积降低一半，浓度即增加一倍。

进行样品浓缩时，选择的超滤膜的MWCO需极低于要截留的分子的分子量，这样才能保证目标分子的完整截留和高度回收。一般情况下，膜的MWCO可以选择为需截留分子分子量的1/3-1/6。如果过滤通量或处理时间是主要考虑的因素，那么可选择MWCO为目标截留分子分子量1/3的膜，以获得更高的流速；如果需要获得较高的收率，则可以选择目标截留分子分子量1/6的膜。

将过滤器或系统连接安装，然后运行系统。推荐先用纯水冲洗系统，并测试过滤器水通量和完整性。添加待处理料液，进行错流进样，监测进样和回流压力，收集回流液（或滤液）即可。当达到所需的浓度后，停止运行，回收样品或开始洗滤。

洗滤

洗滤实际上是一个分馏过程，小分子通过膜被漂洗掉，而大分子被截留在回流液中且不改变其终浓度。洗滤操作可用于清除盐离子或进行缓冲液置换，也可以用于清除乙醇或其它小分子溶剂或添加剂。

洗滤可以不同的模式进行。在连续型洗滤中，洗滤溶液（纯水或缓冲液）连续补加到进样容器，其速率与滤液生成的速率相同。在这种模式中，进样容器中样品的体积保持恒定，而小分子（如盐离子）可自由渗透通过膜而被漂洗掉。比如在脱盐过程中，每添加1体积的洗滤溶液（1体积为洗滤溶液未添加时的样品的体积），盐离子浓度约可降低一半。在连续型洗滤中，添加5体积洗滤溶液，离子强度一般可降低约99%。

而在不连续型洗滤中，溶液先稀释，然后再浓缩回到起始体积，重复操作，直到容器内小分子的浓度降低到要求的浓度。每添加1体积洗滤溶液（1体积为添加稀释溶液前的样品体积），盐离子浓度约可降低一半。在不连续型洗滤中，添加5体积洗滤溶液，离子强度一般可降低约96%。

相比而言，连续型洗滤可以较少的洗滤体积达到相同的脱盐效果。

洗滤前对样品进行浓缩可显著降低洗滤缓冲液的用量。比如通过不连续型洗滤将1L样品的离子强度降低96%，约需要5L的洗滤溶液。如果先将样品浓缩10倍，体积降低为100mL，则仅需500mL洗滤溶液即可完成洗滤操作，可显著节省洗滤溶液和时间。但浓缩可能会增加样品的粘度，从而降低过滤流速，操作前可进行预实验，以达到最佳处理状态。

切向流过滤工艺参数

所有的切向流过滤设备的操作都涉及到2个重要的参数：跨膜压TMP和错流速率CF。

1. 跨膜压是使液体及渗透性分子通过膜的驱动力。
2. 错流速率是溶液进入进样通道并穿过膜的速率，是对膜表面的聚积层进行“清扫”及滤液流速控制的重要参数。

图 简单TFF流路示意图

样品从进样容器泵入进样端口，穿过膜表面（错流），从回流端口流出，回到进样容器。液流可清扫掉截留在膜表面的大分子和聚积物，抑制浓差极化（在膜表面形成的浓缩生物分子层，可堵塞膜孔，造成膜污染）。液体流动通过狭窄的进样通道，在进样和回流端口之间形成压力降。增加错流速率或限制回流端口的软管，可提高此压力。此跨膜压是驱动液体通过膜的动力。

流动通过膜的液体（即滤液或渗透液）可带走比膜孔小的分子。同时调节跨膜压和错流速率可抑制膜污染，提高TFF效率，以在更短的时间内处理更多的料液。

切向流设备的组装

切向流过滤系统一般包括中空纤维切向流过滤组件、蠕动泵、软管、压力传感器及监测系统、样品容器以及相关连接配件。压力传感器一般安装在进样、回流及滤液端口。

不建议在无压力监测设备的情况下进行TFF操作，至少需在泵及TFF组件之间（即进样端口）安装压力监测设备。压力是影响TFF工艺的重要参数。对压力进行监测和控制可得到更加稳定的处理结果，对于系统故障的排除以及工艺的优化都至关重要。

图 TFF系统概图

图 TFF系统实物图

TFF系统操作步骤：

1. 使用前用纯水浸润并预冲洗中空纤维膜组件，以去除甘油等保护剂。
2. 测试膜组件的正常水通量（NWP），作为膜组件性能的基线参考（非必须步骤，如组件需清洗后重复使用，建议进行测试）。
3. 用样品缓冲液润湿调适系统（对系统进行润湿调适可去除系统内的气泡，调整系统温度，并防止因与非缓冲液溶液接触而可能导致的生物分子的沉淀或变性）。
4. 样品处理（浓缩、洗滤或分馏）。
5. 清洗，确认清洗效果。
6. 储存TFF组件。

怎样选择合适的TFF系统

要根据应用选择合适的TFF系统，可按以下步骤进行：

第一步：明确TFF工艺的目的

我们将样品中感兴趣的生物分子成为产物。选择的分离膜可以是截留产物而去除不需要的低分子量污染物，或者允许产物通过而截留样品的高分子量成分。此外，也可以将两种方式相结合，进行两步操作，分别分离开较高及较低分子量的成分。在第一阶段，选择的膜允许产物通过而截留高分子量成分，然后将第一阶段收集的滤液作为样品，进行第二阶段的处理，此时选择可浓缩产物而去除低分子量物质的膜。

操作前，必需先明确分离目的——浓缩、洗滤或分馏。同时，也需要考虑待处理样品的体积，以及可能的规模放大需求。此外，明确工艺最终要求的浓缩因子及脱盐程度，也是选择合适的膜及系统的关键。

第二步：选择合适的膜截留分子量

膜的截留分子量（MWCO）通常定义为溶液中截留率为90%的分子的分子量。如前所示，需要截留产物时，所选膜的MWCO需为目标蛋白分子量的1/3-1/6。而进行分馏操作时，所选膜的MWCO需低于待截留分子的分子量，且高于需去除分子的分子量。

第三步：选择流

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