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，一般重组质粒需要两个酶，所以你要选择两个酶切位点，注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候，在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列，在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点，酶切位点加好后，注意5’端还需要加上保护碱基，这个具体你可以去查下内切酶的说明书。然后你要注意，根据你的载体需要，是否要在引物上带上启动子和终止子。
pCAMBIA 1301这个质粒的启动子35s promter在多克隆酶切位点（MCS)的后面,我该把基因插入到哪个区段?
pCAMBIA 1301这个质粒的启动子35s promter在多克隆酶切位点（MCS)的后面,如果我双酶切Sac I 和Xba I 两个位点,把目的基因插入到它们之间,该基因会表达吗?（35s promter的方向是向右的,这有影响吗?）如果该基因插入到多克隆酶切位点上不表达,那为什么该质粒还要把多克隆酶切位点设置在35s promter之前呢?
1 除非你带上完整的启动子和终止子.35s promter是启动下游Gus基因的,而不是上游的序列.
2 该质粒用来表达你的目的基因时,你必须将完整的基因（启动子+CDS+终止子）一起导入到多克隆位点区；然后转化植物后,你可以通过Gus染色来检测阳性苗.另外你还可以用MCS区的酶切位点加下游的NcoI 或Bgl II双切,将35S启动子置换成你所研究的启动子,这是它主要的用途.
pCAMBIA 1301这个质粒的启动子35s promter在多克隆酶切位点（MCS)的后面,我该把基因插入到哪个区段?
pCAMBIA 1301这个质粒的启动子35s promter在多克隆酶切位点（MCS)的后面,如果我双酶切Sac I 和Xba I 两个位点,把目的基因插入到它们之间,该基因会表达吗?（35s promter的方向是向右的,这有影响吗?）如果该基因插入到多克隆酶切位点上不表达,那为什么该质粒还要把多克隆酶切位点设置在35s promter之前呢?
1 除非你带上完整的启动子和终止子.35s promter是启动下游Gus基因的,而不是上游的序列.
2 该质粒用来表达你的目的基因时,你必须将完整的基因（启动子+CDS+终止子）一起导入到多克隆位点区；然后转化植物后,你可以通过Gus染色来检测阳性苗.另外你还可以用MCS区的酶切位点加下游的NcoI 或Bgl II双切,将35S启动子置换成你所研究的启动子,这是它主要的用途.
- 追问：
- 那如果我的基因没有自带启动子的话，我想用该质粒自带的35s启动子来启动，切掉Gus基因，将它替换成我的目的基因，这样能够表达吗？？？非常感谢这位师兄啊！！！！
- 追答：
- 当然可以，你可以用Nco Ｉ和BstE II 来将你的片段置换上去