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过氧化物酶POD活性测定原理/方法步骤/注意事项

2019-05-22 15:24阅读：

http://blog.sina.cn/dpool/blog/u/6903773088

过氧化物酶（peroxidase, POD）是植物体内普遍存在且活性较高的一种酶，该酶催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应，在氧化其他物质的同时，将H2O2还原为H20,用以清除细胞内的H2O2,是植物体内的保护酶之一 。
此外POD与植物的呼吸作用、光合作用、生长素的氧化 以及木质素的形成等有关，其活性随植物生长发育进程以及环境条件的改变而变化。因此测定POD活性可以反映某一时期植物体内的代谢及抗逆性的变化。本文将会介绍过氧化物酶活性测定的原理、方法实验步骤。
过氧化物酶 原理
在有H2O2存在时POD能催化多酚类芳香族物质氧化形成各种产物，如作用于愈创木酚(邻甲氧基苯酚）生成四邻甲氧基苯酚（棕红色产物，聚合物）,该产物在470 nm处有特征吸收峰，且在一定范围内其颜色的深浅与产物的浓度成正比，因此可通过分光光度法进行间接测定POD活性。
POD测定原理公式
试剂
(1)0.1%愈创木酚
(2)0.18% H2O2:取30%H
2O2 3ml，蒸馏水定量至500ml
(3)标准母液：吸取 5% K2Cr2O7 1.2ml和纯化的10%Co（NO3）2 溶液50ml，混合后加蒸馏水稀释7倍，即为每毫升相当于6.75μg四邻甲氧基苯酚标准母液
方法步骤
（1）标准曲线的制作：取20ml具塞试管6支，编号，按下表配制四邻甲氧基苯酚标准系列溶液，混匀后以1号管调零，于470 nm波长下测定吸光度，以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。或用计算器求出吸光度（Y）随标准液浓度（X）变化的线性回归方程。
试剂 试管号
1 2 3 4 5 6
标准母液/mL 0 1.25 2.50 5.00 7.50 10.00
蒸馏水/mL 10 8.75 7.50 5.00 2.50 0
标准系列含量/μg 0 8.4 16.9 33.8 50.6 67.5
A470

（2）POD的提取：取待测植物样品（如叶片等），剪碎混匀，称取0.5?1.0 g于研钵中，加少量 石英砂、CaC03和适量蒸馏水，冰浴研磨匀浆，蒸馏水定最至50 mL，摇匀后离心，上清液即为待测酶液。
（3）POD活性测定：取20mL具塞试管6支，3支测定（3个重复），3支空白对照。各加入酶液1.0 mL,0.1%愈创木酚1.0 mL，蒸馏水6.9 mL，摇匀，加入0.18% H202 1.0 mL(空白管不加，多加1.0mL蒸馏水），摇匀（计时），25下准确反应10 min,加5%偏磷酸0.2 mL终止反应。用标准曲线1号管调零，于分光光度计上测定3支测定管和空白对照管的A470。
计算公式
式中，X为测定管四邻甲氧基苯酚的含量（mg)；X0为对照四邻甲氧基苯酚的含量（μg)；Vt为酶液总体积(mL);FW为样品鲜重（g)；Vs为测定时取酶液的量（mL)；t为酶作用的时间（min)。
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