脯氨酸含量测定原理/方法步骤/注意事项

在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低；但在逆境，如干旱、寒害、热害、盐碱胁迫等条件下，植物体内游离脯氨酸（proline，Pro）的含量可显著增加。脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质体及组织内的代谢过程。因此，有人提出游离脯氨酸的含量作为植物抗逆性的指标。本实验要求掌握脯氨酸标准曲线的制作，植物体内游离脯氨酸提取及含量测定的方法，了解植物在逆境下脯氨酸含量的变化规律 。
原理
植物体内的游离脯氨酸可以用磺基水杨酸或酒精提取。在酸性条件下，脯氨酸可与茚三酮加热后反应生成稳定的红色产物（此红色产物有互变异构体，其结构如下），520nm波长是其最大吸收峰。产物用甲苯萃取后，在该波长下，A值（吸光度）与溶液中红色产物的含量成正比。因此可以通过标准曲线查出或用回归方程计算出样品脯氨酸的含量。
试剂
(1).酸性茚三酮：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL 2mol·L-1 H3PO4,于70下加热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中备用，4下2-3d内有效。
(2).脯氨酸标准溶液：称取0.025g脯氨酸，溶解在250mL蒸馏水中，其浓度为100μg·mL-1。再取此液10mL，用蒸馏水稀释至100mL，即为10μg·mL-1之脯氨酸标准液。
(3).冰醋酸。
(4).甲苯。
(5).3%的磺基水杨酸溶液。
方法步骤
(1).标准曲线的制作：取7支25mL具塞试管，编号。按下表向各试管加入试剂，摇匀后，沸水浴30min，冷却，各加5.0mL甲苯，充分摇匀萃取。避光静置2-3h。待完全分层后，用吸管吸取甲苯层，用分光光度计以1号标准曲线试管作为空白调零，在