细胞培养中动物血清的常见问题及处理方法与预防措施！

2025-08-18 14:38阅读：

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细胞培养中动物血清的常见问题及处理方法与预防措施！

动物血清（尤其是胎牛血清，FBS）是细胞培养中不可或缺的培养基添加剂，提供细胞生长所需的营养物质、激素、生长因子、结合蛋白等。然而，在使用过程中会遇到各种问题。了解这些问题及其处理方法对于保证实验的稳定性和可重复性至关重要。

一、常见问题

1、沉淀/絮状物：

表现：血清解冻后出现白色、棕色或絮状沉淀物，悬浮或沉于瓶底。

原因：

纤维蛋白/纤维蛋白原：这是最常见的原因，凝血过程中形成，尤其在反复冻融或温度波动时析出。

磷酸钙：血清中钙离子和磷酸根离子在特定条件下（如pH、温度变化）结合形成。

脂蛋白：血清中的脂类在低温或长期保存时聚集。

蛋白聚合物：血清蛋白变性或

聚集。

微粒：过滤不彻底或储存过程中产生。

影响：堵塞滤膜、影响细胞状态（物理刺激、消耗养分）、影响实验观察（如显微镜下）。

2、颜色异常：

表现：

淡黄色/稻草黄：正常颜色。

深黄色/琥珀色：通常由于保存时间过长或储存温度偏高导致血红蛋白（血红素）氧化。

粉红色/红色：明显的血红蛋白污染（溶血），通常由于采血过程处理不当或冻融过程剧烈导致红细胞破裂。

浑浊/云雾状：可能指示细菌污染或高脂血清。

影响：深色可能不影响细胞生长，但影响光学观察。粉红色/红色指示溶血，可能影响某些细胞类型（如神经元）。浑浊需警惕污染。

3、微生物污染：

表现：

细菌：培养基迅速浑浊、pH急剧下降（变黄）、镜下可见大量活动小点。

真菌/酵母：培养基中出现絮状、丝状或点状悬浮物，pH变化，镜下可见菌丝或孢子。

支原体：培养基可能无明显浑浊，但细胞状态变差（生长缓慢、形态改变、易脱落、代谢异常），检测需要特殊方法（PCR、DNA染色、培养法）。

病毒：更难检测，可能通过影响细胞表型或PCR等方法发现。

原因：血清生产、分装、运输、储存或使用过程中无菌操作不当引入。

影响：导致细胞死亡、实验结果无效、交叉污染整个实验室。

4、细胞生长不良/毒性：

表现：细胞贴壁差、增殖缓慢、形态异常、死亡率高、达不到预期密度。

原因：

血清质量差：来源动物健康状况差、生产工艺不佳、内毒素含量高、激素/生长因子水平不足或不稳定。

批次差异：不同批次血清的成分（特别是生长因子、激素）存在自然差异。

灭活处理不当：过度灭活（温度过高、时间过长）破坏有益成分或产生毒性物质。

污染：特别是支原体或病毒污染。

沉淀物影响：物理刺激或消耗养分。

储存条件不当：反复冻融、长期置于4°C或更高温度导致成分降解。

内毒素含量高：内毒素（LPS）对某些细胞（如免疫细胞、原代细胞、干细胞）有很强毒性。

影响：实验失败，结果不可靠，时间和资源浪费。

5、批次间差异：

表现：同一细胞系使用不同批次的血清，生长速度、形态、代谢或特定功能表达不一致。

原因：血清是天然产物，其成分受动物品种、年龄、地理位置、季节、饮食、采血和加工方法等多种因素影响，无法做到完全均一。

影响：实验可重复性差，更换批次时需要重新优化条件或验证。

二、处理方法与预防措施

1、沉淀/絮状物处理：

轻微沉淀（常见纤维蛋白）：解冻后，温和地将血清在2-8°C冰箱中静置过夜，让大部分沉淀沉底。然后小心吸取上清液使用（避免搅动沉淀）。通常不需要过滤去除，过度过滤会损失生长因子。

大量沉淀或怀疑其他类型沉淀：

离心：在2-8°C，以约2000-4000g离心5-10分钟，小心吸取上清液。

过滤：如果必须去除（例如做无血清实验或特殊要求），使用孔径≥0.45μm的低蛋白吸附滤膜过滤（0.22μm过滤会显著损失有效成分）。仅在必要时进行！

预防：

避免反复冻融：购买后立即分装成小份（如50ml），储存于-20°C（短期1-2年）或最佳为-70°C至-80°C（长期保存）。

规范解冻：从-20°C/-80°C取出后，先置于2-8°C冰箱过夜解冻，然后在室温下轻轻摇匀。避免水浴快速解冻或置于37°C（温度骤变易致沉淀）。

轻柔操作：解冻和混匀时动作轻柔，避免剧烈摇晃或产生气泡。

储存温度恒定：长期储存务必在-70°C至-80°C。

2、颜色异常处理与预防：

轻微深黄色：如果细胞生长正常，通常可接受。但新批次建议先测试。

粉红色/红色（溶血）：溶血血清可能含有高水平的游离铁和血红蛋白，对某些细胞有毒或影响实验。

浑浊：高度怀疑污染，立即停止使用并丢弃！彻底清洁相关区域。

预防：

选择信誉良好、质检严格的供应商。

严格遵循储存条件（-70°C至-80°C），避免在4°C长期存放（>1个月）。

规范解冻操作（见沉淀预防）。

3、微生物污染处理与预防：

一旦发现或怀疑污染（细菌、真菌）：

立即隔离：将污染的培养物、培养基、血清、耗材等密封后高压灭菌或浸泡消毒液。

彻底消毒：对培养箱、超净台、实验台面、移液器等进行彻底消毒（消毒剂擦拭、紫外照射、必要时甲醛熏蒸）。

丢弃：污染的血清必须丢弃。

支原体污染：

检测确认：使用PCR或专业检测试剂盒确认。

处理极其困难：通常建议丢弃所有污染的细胞株、培养基和可能污染的试剂（包括该瓶血清），彻底清洁环境，启用新的细胞株和试剂。使用支原体清除试剂处理珍贵细胞株是最后手段，但风险高且可能不彻底。

病毒污染：检测和处理更复杂，通常需要丢弃并彻底消毒。

预防（重中之重！）：

无菌操作：严格遵守无菌操作规程（在超净台内操作，使用无菌耗材，穿戴实验服手套，酒精消毒手和台面）。

定期检测：对新批次血清进行无菌测试（细菌/真菌培养）和支原体检测（PCR或专业试剂盒）。对细胞培养物定期进行支原体检测（如每月一次）。

规范分装使用：血清分装和使用时保持无菌环境，避免将同一吸管/移液头反复插入血清瓶中。取用后及时盖紧瓶盖。

添加抗生素：在培养基中添加适当浓度的抗生素（如青霉素-链霉素）可抑制细菌生长，但不能替代无菌操作，且对支原体/真菌效果有限或无效。

选择辐照血清：伽马辐照处理能有效灭活血清中可能存在的病毒、支原体等微生物，推荐使用，尤其用于珍贵细胞或严格实验。注意辐照对血清成分可能有轻微影响。

4、细胞生长不良/毒性处理与预防：

处理：

更换血清批次：首要尝试。选择经质检合格的新批次。

血清测试：对新批次血清进行细胞生长测试（倍增时间测定）和内毒素检测（LAL法）。选择最适合自己细胞系的批次。

调整浓度：尝试降低或提高血清浓度（但常用浓度范围是5%-20%）。

避免灭活：除非实验明确要求（如补体依赖实验），尽量避免热灭活，因为弊大于利（破坏生长因子，可能产生沉淀）。

预防：

严格供应商选择：选择提供详细质检报告（包括内毒素水平、理化指标、无菌支原体检测、生长促进测试）的知名品牌供应商。

索要并查看质检报告：购买前务必索取并仔细阅读该批次的质检报告（CoA）。

批次测试：对于关键实验或珍贵细胞系，务必对新批次血清进行小规模细胞生长测试，合格后再大量使用。

预留库存：对于验证过的好批次，尽量多购买一些同一批次的血清，分装冻存备用。

规范储存与解冻：如前所述。

关注内毒素：对于敏感细胞（干细胞、原代细胞、免疫细胞），选择内毒素含量低的血清（如<10 EU/mL，甚至<5 EU/mL）。

5、批次间差异处理与预防：

处理：

批次测试：每次更换新批次前必须进行严格的细胞生长和功能测试，确保能满足实验要求。

混合使用：在旧批次快用完时，提前引入新批次血清，新旧批次按比例混合使用一段时间，让细胞逐渐适应。

预留库存：同上。

预防：

选择来源稳定、质检严格的供应商：大品牌通常能提供相对更稳定的产品。

尽量使用同一批次：对于长期项目，一次性购买足够量的同一批次血清。

详细记录：对使用的每一瓶血清的批次号进行详细记录。

重要注意事项：

血清验收：新批次血清到货后，检查外观（颜色、是否溶血、有无大量沉淀）、包装完整性、标签信息（批号、有效期、储存条件）是否与订单一致。核对供应商提供的质检报告（CoA）。

灭活的争议：除非实验特殊需要（如灭活补体），越来越多的证据表明热灭活通常是不必要的，且可能有害（破坏生长因子、增加沉淀风险）。仅在明确需要时才进行灭活（56°C水浴30分钟，期间轻轻摇动几次）。

血清替代物：对于某些细胞类型或特定研究目的（如研究生长因子作用、生产治疗性蛋白），可考虑使用化学成分明确的无血清培养基或添加特定生长因子的血清替代物，以消除批次差异和动物源性风险。

总结：

有效管理动物血清的关键在于：严格供应商选择与质检报告审核、规范储存（-70°C至-80°C分装）与解冻（2-8°C过夜）、严格遵守无菌操作规程、对新批次进行严格的细胞生长测试、避免不必要的热灭活、警惕沉淀和颜色变化、定期检测支原体、预留同批次库存并做好详细记录。通过采取这些预防措施和及时处理问题，可以最大程度地减少血清相关问题对细胞培养实验的影响。

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