羊原代乳腺上皮细胞的标准分离培养与纯化流程及鉴定！
2026-02-27 14:08阅读：
羊原代乳腺上皮细胞的标准分离培养与纯化流程及鉴定！
羊原代乳腺上皮细胞（Goat/Sheep Primary Mammary Epithelial Cells,
PMECs）的核心知识，涵盖定义特性、分离培养、鉴定质控、功能应用及常见问题，便于直接指导实验室操作。
一、基本定义与生物学特性
来源与定位：取自羊正常乳腺组织的腺泡/导管上皮，是乳腺中唯一具备泌乳功能的细胞；体外为贴壁生长的多角形上皮样细胞，常呈岛屿状、铺路石样单层排列，有接触抑制。
关键标志物：细胞角蛋白、上皮膜抗原（EMA）阳性；波形蛋白（成纤维细胞标志物）阴性；具备泌乳功能的细胞可表达
β- 酪蛋白、α- 乳清蛋白，油红 O 染色可见胞内脂滴。
纯度与质控：合格细胞纯度 >
90%，无支原体、细菌、真菌污染；核型正常（山羊 60
条染色体）；原代/早期传代（P1-P3）保留泌乳分化潜能，传代过多易出现表型丢失。
二、标准分离培养与纯化流程
取材预处理：
无菌取健康泌乳期或孕晚期羊乳腺组织，剔除脂肪、结缔组织与血管；D-Hanks/ PBS（含双抗）反复漂洗，切成 1 mm³
小块。
两种主流方法
酶消化法（效率高）： 型胶原酶 +
透明质酸酶 37消化 3–4 h；过滤后用胰酶 + EDTA 短时间消化分散，终止后离心；差速贴壁（1–2
h）去除成纤维细胞，获得富集上皮细胞。
组织块法（损伤小）：组织小块均匀铺于胶原包被的培养瓶，37、5%
CO静置 2–3 天；待细胞从组织边缘爬出后换液，后续用差速消化/刮除法纯化。
培养基与培养条件：常用 DMEM/F12 或专用上皮培养基，添加
FBS（5%–10%）、EGF、ITS；37、5% CO、湿度 95%；避免频繁移动培养瓶。
传代与冻存：细胞汇合 80% 时消化；冻存液用 90% FBS+10%
DMSO，程序降温后入液氮；复苏快速 37水浴，离心去冻存液后接种。
三、鉴定方法（多重验证）
形态学：光学显微镜观察铺路石样上皮形态；电镜可见丰富微绒毛、粗面内质网与分泌小泡。
免疫荧光/ Western blot：CK-18 阳性率 >
90%，波形蛋白 < 10%。
功能验证：催乳素（PRL）诱导后，ELISA/ RT-PCR 检测 β-
酪蛋白表达；检测培养基中乳糖/乳蛋白分泌量。
无菌检测：支原体 PCR、培养基无菌对照培养。
四、核心应用场景
泌乳机制研究：激素、信号通路对乳腺分化与乳成分合成的调控。
乳腺疾病模型：构建乳腺炎、乳腺肿瘤细胞共培养模型。
生物反应器：基因转染/病毒感染实现重组蛋白的乳腺特异性表达。
畜牧育种：比较不同品种乳腺上皮细胞的泌乳能力差异。
五、常见问题与质控要点
成纤维细胞污染：优先用差速贴壁 +
差速消化（胰酶对成纤维细胞更敏感）；用胶原包被培养瓶提升上皮细胞贴壁效率；必要时添加抗成纤维细胞抗体。
细胞不增殖/活力低：检查培养基配方与添加剂是否过期；确保无菌与
CO浓度稳定；避免胰酶消化过度；原代细胞尽量在 P3 代内完成实验。
泌乳功能丧失：添加催乳素、皮质醇的组合诱导分化；避免血清浓度过高抑制分化；尽早冻存 P1-P2
代细胞。
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