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微生物计数检查方法验证中，如何确定方法的检测限？

2026-02-27 14:34阅读：

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微生物计数检查方法验证中，如何确定方法的检测限？



百欧博伟生物：微生物计数检查方法验证中，检测限（LOD）的确定核心是找到方法能稳定检出目标微生物的最低浓度，需通过“梯度稀释 + 平行试验 + 概率判断”的逻辑，排除药品基质干扰，确保结果可靠。

检测限的确定需围绕“药品基质是否有抑菌性”分基础流程和特殊处理，同时严格设置对照，避免假阴性或假阳性结果。

一、确定检测限的核心原则

目标聚焦“最低可检出浓度”：不同于化学检测的“定量限”，微生物检测限更关注“是否能检出”（定性属性），而非“准确计数”，需通过多次试验验证稳定性。

必须结合药品基质：检测限需在“供试品溶液 + 微生物”的体系中确定，不能仅用空白稀释液测试，避免忽略药品抑菌性导致的“假高检测限”。

依赖概率判断：因微生物分布存在随机性（如 1~10 CFU/mL 的溶液中，某 1mL 可能不含微生物），需通过多份平行样品的检出率判断，而非单次结果。


二、基础操作流程（适用于无抑菌性或弱抑菌性药品）

按《中国药典》及 ICH Q2 (R1) 指导原则，标准流程分 4 步，需同步设置 3 类对照，确保结果有效。

1、准备工作：确定关键材料与参数

对照菌株选择：需覆盖药品可能污染的微生物类型，至少包含 2 种代表性菌株（如细菌选金黄色葡萄球菌，酵母菌选白色念珠菌，霉菌选黑曲霉），菌株需为药典规定的标准菌株（如 ATCC 菌株）。

供试品溶液制备：按待验证的微生物计数方法，制备供试品溶液（如固体药品需研磨后溶解、稀释，液体药品直接稀释），确保与实际检测时的样品处理方式完全一致。

稀释液选择：使用无菌稀释液（如胰酪大豆胨液体培养基、0.9% 无菌氯化钠溶液），需与供试品溶液兼容，无额外抑菌或促生长作用。

2、核心步骤：梯度稀释与平行试验

菌株梯度稀释：将标准菌株用无菌稀释液稀释至1~10 CFU/mL 的低浓度区间（预试验确定大致范围），确保每 1mL 稀释液中微生物数量接近“可能检出的临界值”。示例：若预试验发现 10 CFU/mL 时 100% 检出，5 CFU/mL 时部分检出，则重点测试 5 CFU/mL 和 1 CFU/mL 两个梯度。

样品制备与培养：

取上述低浓度菌液，按“供试品溶液：菌液 = 9:1”的比例混合（或按待验证方法的加样体积比例），制备至少 5 份平行样品（越多越能体现随机性，通常 5~10 份）。

同步设置 3 类对照，排除干扰：

阳性对照：空白稀释液 + 低浓度菌液（无药品基质），验证菌株活性和培养条件是否合格。

供试品空白对照：供试品溶液 + 无菌稀释液（无微生物），验证药品本身是否有杂菌污染。

培养基空白对照：仅培养基，验证培养基无菌性。

培养与观察：按待验证方法的条件培养（如细菌用 TSA 培养基 30~35培养 18~24h，霉菌用 SDA 培养基 20~25培养 5~7d），观察每一份样品是否出现目标菌落（需与阳性对照的菌落形态一致，排除杂菌）。

3、结果判断：基于检出率确定检测限

核心标准：若某一浓度下，≥90% 的平行样品能检出目标微生物（即出现符合形态的菌落），且阳性对照 100% 检出、空白对照均无菌落，则该浓度即为方法的检测限。

示例：测试 5 CFU/mL 时，5 份样品中有 5 份检出（100%）；测试 1 CFU/mL 时，5 份样品中有 3 份检出（60%），则检测限为 5 CFU/mL。

特殊情况：若所有测试浓度的检出率均低于 90%，需返回“消除药品抑菌性”步骤，重新优化方法后再测试。

二、特殊情况处理：含抑菌性药品的检测限确定

抗生素、消毒剂、含生物碱的中药等具有强抑菌性，直接按上述流程测试会导致微生物无法生长（检出率 0%），需先消除抑菌性，再确定检测限，常用方法如下：

稀释法：将供试品溶液用无菌稀释液（如胰酪大豆胨液体培养基）稀释至“抑菌性消失的浓度”（通过预试验确定：如稀释 100 倍后，加入 100 CFU/mL 的菌株，回收率能达到 50% 以上），再按基础流程测试检测限。

中和法：在供试品溶液中加入能特异性中和抑菌成分的试剂，如用 β- 内酰胺酶中和青霉素类抗生素，用硫代硫酸钠中和含氯消毒剂（需验证中和剂无毒性，且不影响微生物生长），再进行梯度稀释和检出试验。

过滤法：用无菌滤膜（孔径 0.45μm）过滤供试品溶液，微生物会截留于滤膜上；用无菌稀释液冲洗滤膜 3~5 次（去除残留抑菌成分），再将滤膜转移至培养基表面培养，后续按基础流程判断检测限。

三、注意事项：避免检测限确定结果失真

稀释操作需严格无菌：所有稀释液、移液管、容器需灭菌，操作在无菌操作台内进行，防止外界微生物污染导致“假阳性”，误判检测限。

菌株活性需验证：使用前需将标准菌株活化（如在 TSA 培养基上传代 1~2 次），确保菌株处于对数生长期，避免因菌株活性低导致“假阴性”，低估检测限。

平行样品数量足够：至少制备 5 份平行样品，若样品量允许，可增加至 10 份，减少微生物随机分布对结果的影响（如 1 CFU/mL 的溶液中，某 1mL 可能恰好不含微生物，多份样品可降低这种偶然性）。

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