质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析
2008-11-23 19:58阅读：
摘要：限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和锈蚀现象中发现的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。BamHⅠ和PvuⅡ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上特异核苷酸序列的能力，并在这个序列内切断DNA的双链。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段。因此，用电泳鉴定酶切后的区带数，就可以推断酶切口的数目；从片段的迁移率可以大致判断酶切片段的大小。
关键词：质粒DNA 限制性内切酶 电泳 酶切
限制性内切酶: 在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。
本实验选用的BamHⅠ和PvuⅡ都属于Ⅱ型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上特异核苷酸序列的能力，并在这个序列内切断DNA的双链。BamHⅠ和PvuⅡ的识别序列和切口分别如下：
BamHⅠ：G↓GATC C
PvuⅡ：CAG↓CTG
C CTAG↑G
GTC↑GAC
1实验目的：
掌握限制性内切酶酶切方法和DNA琼脂糖电泳
2实验原理：
2.1本实验采用BamHⅠ酶切pBR322质粒DNA，可将环状的质粒DNA切割成一条线状的片段。pBR322全长为4362bp，BamHⅠ的切割位点在375bp处。经琼脂糖凝
胶电泳分离酶切片段，与未酶切的对照相比，可观察到酶切的结果。
同时，这次电泳还要鉴定上次实验自己提取纯化的pGEM-3zf(+)质粒DNA的纯度，pGEM-3zf(+)质粒DNA的分子大小为3199bp。
2.2琼脂糖溶胶和凝胶之间的互变
不同的琼脂糖浓度适合分离不同分子量范围的DNA。琼脂糖浓度越大，网孔越小，适合分离较小的DNA分子；琼脂糖浓度越小，网孔越大，适合分离较大的DNA分子。
2.3琼脂糖凝胶电泳测DNA分子量
在一定的范围内，线状DNA的泳动距离与其分子大小的对数呈线性关系。
2.4未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。
超螺旋DNA >线形DNA>松弛螺旋状DNA
3实验需配制的试剂:
3.1溴化乙锭溶液：用蒸馏水或电泳缓冲液配制成1mg/ml，避光保存。
3.2 0.5×TBE：89mmol/L Tris，89mmol/L硼酸，2mmol/L EDTA，pH8.3。称取Tris
2.72g，硼酸1.38g，EDTA-Na2
0.18g，用蒸馏水溶解后，定容至500ml。（此溶液由学生自己配制，根据电泳槽的大小计算出需配制溶液的体积）
3.3加样缓冲液：0.25％溴酚兰，40％蔗糖水溶液（或30％甘油水溶液）。
4加样缓冲液的作用:
4.1增大样品密度，以确保样品均匀进入加样孔中；
4.2使样品呈现颜色，便于加样；
4.3估计样品泳动距离。(以0.5×TBE作电泳液时，溴酚兰在琼脂糖凝胶中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，在琼脂糖浓度为0.5-1.4％的范围内，这种对应关系受凝胶浓度变化的影响不明显。)
5质粒样品的制备：
编 号
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1
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2
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3
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pBR322(μl)
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1
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1
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自提pGEM-3zf(+)质粒(μl)
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10
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10×buffer B(μl)
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2
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10×乙酰化BSA(μl)
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2
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BamHⅠ(μl)
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1
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水
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14
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9
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37℃反应2小时
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加样缓冲液(μl)
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4
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4
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4
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6实验步骤：
6.1制胶
根据胶板大小计算需配制胶液的体积，以0.5×TBE作溶剂，配制1%的琼脂糖胶液。加热使琼脂糖完全溶解，当胶液冷却到60℃时（温度过高会使有机玻璃变形），加入1mg/ml的溴化乙锭母液，使溴化乙锭终浓度为0.1μg/ml，混匀后灌胶，胶厚约4mm。当凝胶完全冷却凝固后，除去透明胶带和加样梳，在电泳槽中加入电极缓冲液(0.5×TBE)至恰好没过胶面约1mm深。
6.2加样
用微量移液器将样品加到加样孔中。
6.3电泳
盖上电泳槽盖并通电，使DNA向阳极泳动。采用1-5V/cm的电压降(按两极间距离计算)。几分钟后，溴酚兰从加样孔中迁移到凝胶中。继续电泳直至溴酚兰在凝胶中迁移出适当距离（约整个胶的2/3）。
切断电流，从电泳槽上拔下电线，将电泳后的凝胶放在254nm的透射紫外灯上观察电泳结果，凝胶中的DNA呈现红色的条带。
7安全注意事项：
7.1本实验要用到溴化乙锭，溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性。使用含有该染料的溶液时必须带手套。
7.2电泳后的电极缓冲液必须倒入指定的废液桶中，按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时，用滤纸过滤并将活性碳与滤纸作为有害废物予以焚烧，滤液可直接排放。
7.3含溴化乙锭的凝胶及使用过的手套、枪头等必须焚烧处理。
7.4学生在离开实验室前充分洗手。
8实验结果：
9实验讨论：
1.核酸分子迁移率与琼脂糖浓度的关系
（1）DNA的分子大小：DNA分子通过琼脂糖凝胶的速度（电泳迁移率）与其相对分子质量的常用对数成反比。
（2）琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。DNA的电泳迁移率（
M）对数和凝胶浓度（
T）之间的线性关系可按下述方程式表示
lg
M ＝ lg
M。－
KrT
式中，
M。是自由电泳迁移率，
Kr是滞留系数，这是与凝胶性质、迁移分子大小和形状有关的常数。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的，
（3）琼脂糖浓度与电压关系：通过对琼脂糖凝胶电泳分离大分子DNA条件的研究，发现以低浓度、低电压分离效果较好。胶的浓度越低，适用于分离的DNA越大，这是一个总的规律。不过浓度太低，制胶有困难，电泳结束后将胶取出来也有困难。在低电压情况下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。但是如果电压增高，电泳分辨力反而下降。因为电压升高了，样品流动速度增快，大分子在高速流动时，分子伸展开了，摩擦力也增加，相对分子质量与移动速度就不一定呈线性关系。
2.核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
根据Aaij和Borst用琼脂糖凝胶电泳研究的结果，发现在相对分子质量相当的情况，DNA的电泳速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA（本实验结果也应如此），参看图1-4。但琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般位球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（
Rm=0），而同样大小的直线双链DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前进（
Rm＞0）。由此可见，构型不同，在凝胶中的电泳速度差别较大。用琼脂糖凝胶电泳相差一个超螺旋的DNA也可以分开。除DNA外，RNA同样也如此。
3.pUC19的电泳行为
（1）标准质粒pUC19与自己提取的pUC19未经酶解，在电泳图谱上应观察到3条带。
（2）标准质粒pUC19与自己提取的pUC19经过酶解（
EcoRⅠ或
HindⅢ，也可以用其他单一切口的酶）只观察到一条带，因为它具有多个限制性内切酶的单一切点。如果不是一条带，可能由于酶量加得不足，使pUC19不能完全被酶解成线性分子，而掺有其他形状分子所造成。
