凝胶研究综述
2014-01-05 20:34阅读：
凝胶研究综述
凝胶的种类及性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
⑴Sephadex
G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，
能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia
），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，
由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P
（Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P
后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构，
可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，
直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释
度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。
分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
（二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex
G-20的吸水量为20，1 克Sephadex
G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex
G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
（三）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，
自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex
G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。
分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:
⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.
01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
研究凝胶的方法
原子力显微镜（AFM）用于蛋白质凝聚凝胶。AFM起源于隧道扫描显微镜技术，它广泛应用于生物、物质结构、分子生物学等领域。AFM用于食品科学中以下六个方面014]：AFM可以定性描述食品大分子的结构；通过AFM成像提供的结构参数描述食品加工和储存过程中定量分析分子结构变化；显示不同分子之间的相互作用；为操控食品大分子提供条件；描述食品表面因物理特性变化而带来的细微变化；加工纳米食品的工具。
1．1 AFM的原理
AFM的成像是通过“感觉”而非“观察”样品。在AFM观测样品时，一个安装在悬臂上的尖端扫描样品表面，通过记录悬臂的偏斜，通过激光二极管发出的激光照射在悬臂的末端，经过镜面反射把激光发射到光电二极管检测器上，得到悬臂偏斜的信号。
当扫描样品时，样品表面的拓扑结构通过尖端和样品力的变化使悬臂发生偏斜。通过电脑处理悬臂偏斜变化形成样品表面三维结构¨5|。AFM的观测模式有三种：接触、非接触和轻敲。在接触模式中，尖端始终与样品表面接触，而非接触模式中，悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。轻敲模式中，尖端与样品间歇接触，通常每秒接触300
000次，减少接触模式中产生的剪切力对于样品的破坏，这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品。
1．2 AFM的特点
与传统的电子和普通光学显微镜相比，AFM具有以下优点¨4．16J。
①具有高分辨率和大的放大倍数。AFM没有透镜，因此不受衍射极限或者球面像差的限制，对于某些样品可以实现原子级别的分辨率。②简化样品处理的过程。AFM是非破坏的分析方法，不需要染色或是覆膜处理，也不用高能量的粒子流，不需要导电衬底，不受样品稠度的影响，观测时样品可以处于溶液中，基本达到在天然状态下或是近似天然状态下观测样品。
③可同时得到样品的二维和三维成像。
④可以连续的观测样品变化，所以可以直接观测正在进行的反应过程。如酶反应的过程。
⑤为操控大分子和调查大分子之间的相互作用提供了可能。然而，目前AFM也有以下缺点：相对较小的扫描面积，较慢的扫描速度，对于过于软的样品成像困难等
1．3 AFM在蛋白凝聚和凝胶上的应用
AFM能有效地提供凝胶结构信息，进而补充流变仪或化学分析蛋白凝聚结构信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白热凝聚现象，研究发现乳清蛋白凝聚体显示了同p一乳球蛋白凝聚体相似的微观结构¨7|。在pH
7时，无论NaCl浓度如何变化，乳清蛋白凝聚体主要由椭球形微粒构成。以上研究结果对于理解不同条件下得到的热导致乳清蛋白凝胶特性差异提供了基础。采用轻敲模式AFM观察到加热后B一乳球蛋白，发现它形成一种有规律的纤维结构，长度约25nm，厚度是1或2个蛋白单体¨4|。这证明在低pH低离子强度下，形成的热导致p一乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反应。
1wasaki等¨41采用AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响，发现在70℃时原来的串珠结构变成绳子结构，但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。Yang等¨副使用AFM观察鲶鱼凝胶结构，发现鲶鱼凝胶中具有平均直径为1
18 nm的环形孑L洞球形凝聚体的平均直径为267
nm。他们认为球状凝聚体和环形孑L洞的形成与水和离子渗透过正在水解胶原质时的方式有关。
AFM能从分子水平上解释食品流变学特性的差异，从力学的角度揭示蛋白凝聚特性。1wasaki等【19】报道了采用AFM分析由热导致和压力导致的细丝状肌浆球蛋白凝胶中的串珠结构和弹性之间的关系。近期出现的阶段成像，力调制模式等新技术，使AFM能够定量测定物质弹性。AFM也应用于分析蛋白凝聚动力学。Yay等啪J使用AFM分析采用GDL导致不同大豆蛋白凝聚的过程。将11S、7S、2S在100℃加热10
min后，加入GDL，采用AFM观测它们形成不同的凝聚曲线。单位时间内，11S形成体积最大的凝聚团，2S形成的凝聚团其次，7S的凝聚团最小，所以可以推测11S的凝聚速度最快，7S最小。虽然AFM已经成功地运用于食品蛋白凝胶领域，但是对于观测高度复杂的真实食品体系，还存在不足，有太多其他组分和组分问相互作用会干扰对调查对象的分析。但是随着技术的发展，AFM必然会广泛的应用于真实的食品体系。
2 CSLM用于蛋白凝聚凝胶
与传统的荧光显微镜相比，由于采用自动的显微镜技术、荧光探针技术、高容量和高强度的图片处理软件等先进技术，CSLM具有很高的放大倍数和高的分辨率。CSLM已经广泛的应用于分子生物学㈨、免疫学、药剂学‘圳、基因学、生理学‘圳等领域。
2．1 CSLM的原理
利用激光束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。CLSM采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了1个带有小孔的挡板，平面以外的杂散光被挡住，消除了球差，并进一步消除了色差，且可将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像，再通过微机组合成1个平面的或立体的图像埘硒J。
2．2 CSLM的特点
CSLM已经逐渐用于食品微结构的研究，有如下特点汹]：避免固定或者脱水操作，避免破坏样品，因此减少了样品制备的时间和对样品性质的改变；荧光探针的使用可以特定观察食品的某种成分，提高检测的灵敏性和特异性；食品结构的变化町以连续的监测；“光切片”技术可以确保不破坏微观结构的条件下，观测表面以下不同深度切面的微观结构。虽然CSLM有诸多优点，但是CSLM还有以下缺点：受衍射极限的限制，CSLM观测某些蛋白和酪蛋白胶束的分辨率最高达到0．2仙m以上；同时某些与样品采用共价键结合的荧光探针会改变样品结构的影响∞7|。此外，荧光信号逐渐减弱，会影响测定结果；扫描速度慢，并且目前CSLM不能检测静止的食品体系。
2．3 CSLM在蛋白凝聚凝胶中的应用
由于CSLM适宜观察处于天然状态下食品体系Ⅲ]，所以CSLM已经用于分析食品胶体，如蛋白一多糖相分离，蛋白凝胶结构，乳化和泡沫稳定性029—34I。CSLM可以用于测定胶体形成动态过程ⅢJ。CSLM已经观测了采用凝乳酶导致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝胶的过程。起初，酪蛋白呈现出粒径小于0．5斗m细微分散的小颗粒，15
min后，酪蛋白颗粒开始发生凝聚，最终凝胶形成三维网络结构。从CSLM分析发现，除了在低脂牛奶中脂肪球个数远少于全脂牛奶和凝胶速度低于全脂牛奶以外，低脂牛奶和伞脂牛奶凝胶过程相似。采用CSLM观测GDL导致的凝胶过程时，发现在加入GDL后1—20
rain(pH 6．5l～5．64)，一些粒径小于1“m蛋白微粒在各个方向上随机快速运动，30
min后，pH下降到5．58时，粒径小于2斗m牛奶蛋白的凝聚体成为体系的主体。开始发生凝胶化并形成可见的蛋白网络是在pH
5．4，而此时蛋白已经完伞静止。
CSLM能够清楚的描述在凝聚凝胶过程中大分子之间的相互作用，如多糖一蛋白、蛋白一蛋白。Sittikijyothin等旧纠使用CSLM研究由13一乳球蛋白和他拉胶形成的混合胶。单纯的13一乳球蛋白凝胶呈现均质性，而混合胶具有两个相。13一乳球蛋白发生凝聚后，形成富含蛋白的连续相，他拉胶构成分散相。他拉胶浓度显著影响混合胶的微观结构，当增加他拉胶浓度时，会产生更具有开放性和不均匀的混合胶结构。Gon(；alves等哺1研究由B一乳球蛋白和刺槐豆胶形成混合胶也具有相似的结构∞6‘。
Schmitt等旧刊采用CSLM研究发现：总浓度为1％的13一乳球蛋白和阿拉伯胶，与总浓度1％的全溶13一乳球蛋白和阿拉伯树胶形成的凝胶完伞不同。球状混合聚集物的沉淀平衡系数受构成聚集层的两种物质比例的影响。当蛋白浓度上升时，产生尺寸巨大、数量众多沉淀，这砦沉淀由阿拉伯树胶包围的蛋白质凝聚团组成。而凝聚团由含有单个小泡颗粒(气泡表观直径4～10斗m)和含有泡沫颗粒(气泡大小相对均一，直径在2～4¨m)构成。在全溶B一乳球蛋白和阿拉伯树胶形成分散体系中主要是含有单个气泡的颗粒团。产生不同微粒的原冈是：13一乳球蛋白和全溶13一乳球蛋白的分散性不同造成的。
CSLM提供了加热乳清蛋白和13一乳球蛋白可以形成复杂的凝胶网络的证据。疏水相互作用和氢键诱导13一乳球蛋白分子吸附到乳清蛋白上旧J。这一点在CSLM的照片上可以清楚地看到二者的荧光信号重合在相同的区域。此外，CSLM还显示B一乳球蛋白对于乳清蛋白凝胶结构的影响，当降低B一乳球蛋白的含量时，形成的混合凝胶网络更均匀。动态CSLM也成功地用于分析环境因素如离子强度、pH、时间等对于凝胶结构的影响。采用动态CSLM可以清楚地观测到离子强度和pH对蛋白网络结构的影响。在低离子强度和高pH条件下，CSLM观测到酪蛋白形成带有大孔洞的粗糙网络结构，而在高的离子强度和低的pH条件下，形成蛋白网络比较均匀，孔洞尺寸较小旧1。这是由于酪蛋自在高离子强度下的去稳定化要慢于低离子强度，并且需要更低的pH条件来减少胶束表面的电荷，所以形成凝胶的速度较慢，容易形成结构精细的凝胶网络结构。3
DWS用于蛋白凝聚凝胶
DWS起源于传统的激光散射技术。由于多散射光子叠加，使传统的静态或是动态激光散射技术都不能用于高浓度的胶体体系，只能分析稀释的悬浊体系，其浓度大约0．01％。而凝胶化、相分离和絮凝现象发生的浓度，都高于激光散射测量的浓度范围闱J。但DWS却可以用于混浊的胶体体系，因此，DWS可以用于研究乳化剂、胶体、化妆品等领域。
3．1 DWS的原理
当激光照射到组成胶体的颗粒上时，导致发生共振和散射，而且散射光受颗粒运动状态的影响H1|。DWS测定的是在颗粒间发生多次散射光子，这时光子的运动途径可以看作随机运动或是散布运动。因此，随时间变化的散射光强度直接与样品中颗粒运动状态有关，测定散射光变化，即可推出颗粒运动状态，进而得出凝聚的状态。
DWS有两种构造类型：同侧型和穿透型，同侧型，收集器和检测器与激光发射源在同一侧；穿透型收集器和检测器与激光发射源在异侧，所以散射激光必须穿过整个悬浊样品，散射激光的强度较高。同侧型的缺点是有时收集的散射光没有发生足够散射，但是它具有激光能量低并且易于安装设备的优点，因此用于食品凝聚凝胶化的研究。
3．2 DWS的特点
DWS可以在线测定未稀释或是未预处理过样品，得到凝聚颗粒的尺寸、空间相关性的信息。但缺点是：DWS不能用于已经完全形成的凝胶，因为此时颗粒已经完全静止，体系中没有微粒移动，就不能用复杂的相关函数来推导凝胶的信息。目前没有商业化DWS设备，只是一些实验室自制的DWS设备。因此，DWS的发展受软件和硬件的限制。
3．3
DWS在蛋白质凝胶凝聚中的应用目前，DWS主要用于研究初始状态下的食品凝聚凝胶化过程，如通过添加凝乳酶或酸化导致牛奶凝胶化过程，并测定凝胶网络的黏弹性H卜州。研究表明，DWS能够准确测定凝结时间，并且能找到散射光强度变化和形成结构弹性之间的联系。DWS通过测定光子运动平均自由行程(f’)的变化，发现使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝胶差异明显。参数￡+是穿透性DWS特有的表征微观结构发展变化和不同类型凝胶形成机理的指标。凝胶化过程中，Z‘的变化要早于颗粒凝聚尺寸变化和流变学变化。在酸化和凝乳酶诱导的凝胶体系中，随时间变化，两者的Z‘不同，所以证明在两种凝胶化过程中蛋白质问不同的相互作用类型M引。
即使在发生凝结之前，DWS显示在光子平均自由行程上加热和未加热的牛奶有明显的差别ⅢJ。在加热后的牛奶体系中，从加入酸化剂到pH下降到5．5时，酪蛋白胶束表观半径逐渐呈现线性下降了20nm。当pH到达5．4时，颗粒的表观半径开始逐渐缓慢上升，直到pH到达5后，颗粒的表观半径爆炸性增长。而在未加热牛奶中z+在pH
5．4就已经有相当大的增加，而此时颗粒尺寸并没有较大的变化，这就意味着在这个体系中，颗粒间存在力的相互作用早于形成凝聚。这种相互作用在加热后的牛奶中表现更为明显，当开始酸化pH为6．0以上，颗粒的尺寸没有变化时，颗粒间的相互作用就已经表现出来了。以上结果表明，加热牛奶中的酪蛋白胶束在未发牛凝聚时，已经被乳清蛋白和K一酪蛋白形成的微弱的凝胶网络限制了移动，并最终发生凝聚。这一假设通过使用改变牛奶中酪蛋白胶束和乳清蛋白比例，得以验证一“。采用DWS研究酪蛋白胶束表明，只有当凝乳酶水解掉90％以上的K一酪蛋白后，酪蛋白胶束才开始凝聚Ⅲ1。只要有少量“毛发”K一酪蛋白存在，以及体系中残留乳清蛋白的存在，就能阻止酪蛋白胶束的凝聚。DWS研究发现：转谷氨酰胺酶处理过的酪蛋白胶束通过分子内部的相互作用，也能阻止凝乳酶导致的凝聚发生【49J。
蛋白质凝胶的机理和凝胶动力学
摘
要：凝胶特性是食品蛋白质的重要功能特性，蛋白质的凝胶行为及其流变性质是形成某些食品独特的质构、感官和风味的决定性因素。长期以来，人们对蛋白质的凝胶行为进行了广泛深入的研究，但对蛋白质凝胶的机理和凝胶动力学还没有完全了解。本文对当前有关蛋白质凝胶的类型、凝胶过程中蛋白质分子构象的变化、形成蛋白质凝胶的主要作用力和凝胶动力学过程的研究进展作了综述。随着现代分析研究技术的进步，对蛋白质凝胶行为的认识也逐渐深入。
关键词：蛋白质，凝胶机理
