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溶壁微球菌培养方法主要包括：
1、溶壁微球菌培养基的制备：将添加适量的营养物质、碳源和氮源混合溶解，搅拌均匀，加入适量的水，经加热消毒后，即可得到溶壁微球菌培养基。
2、溶壁微球菌的接种：将溶壁微球菌悬浮液滴入溶壁微球菌培养基中，摇动均匀，加入盖玻片，然后置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的培养。
3、溶壁微球菌的分离：将溶壁微球菌培养液用滤筛分离，收集滤液，再置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的分离。
4、溶壁微球菌的纯化：将溶壁微球菌分离液滴入溶壁微球菌纯化培养基中，摇动均匀，加入盖玻片，然后置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的纯化。
溶壁微球菌不耐热。微生物菌种应保藏于低温、清洁和干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退。溶壁微球菌具体用于溶菌试验。
三、应用
溶壁微球菌细胞可以用于大菱鲆热休克蛋白Hsp47的功能研究：
以高温胁迫条件下,皮肤转录组测序数据中筛得的热休克蛋白47(HSP47)基因为研究对象,运用细菌结合、凝集及抑制等试验方法对其免疫功能等进行研究,分析HSP47在高温胁迫条件下大量表达的原因,并通过对关键位点的定点突变,高效地分析其所表达的目的蛋白的性状及表征,从而分析HSP47蛋白质结构和功能之间的复杂关系。
大菱鲆热休克蛋白Hsp47对病原相关分子模式的刺激响应。通过RACE技术克隆SmHsp47的c DNA全长1927bp,并进行了生物信息学分析,与其他物种的序列比对显示,分别存在42.76%-81.25%的氨基酸序列一致性。对大菱鲆进行病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns,PAMP)脂多糖(LPS)和磷壁酸(LTA)的刺激,探讨SmHsp47基因对其刺激响应,q PCR实验结果显示,SmHsp47对LTA具有明显的刺激响应。
大菱鲆热休克蛋白Hsp47的免疫相关功能研究。利用已克隆得到的完整SmHsp47基因序列,构建了原核表达载体,经诱导表达,最终鉴定目的蛋白主要以包涵体的形式进行表达,对目的蛋白进行重组复性,得到SmHsp47重组蛋白。对重组蛋白进行了三种丝氨酸蛋白酶抑制活性的研究,结果显示SmHsp47对三种丝氨酸蛋白酶均无抑制活性,属于非抑制型。
利用重组蛋白对细菌进行结合,实验结果显示,SmHsp47与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌相互作用,说明SmHsp47可能在细菌攻击期间的免疫防御的方面起作用,可能用于识别入侵细菌;在体外细菌凝菌与抑制活性试验中,SmHsp47重组蛋白特异性的对溶壁微球菌有凝菌及抑菌活性;运用His-pull down技术筛选出在鱼体总蛋白中与SmHsp47相互作用的蛋白,为进一步分析SmHsp47的功能提供参考。
通过定点突变分析氨基酸位点对大菱鲆免疫相关功能的影响。为了了解SmHsp47结构与功能的关系,选取了几个关键的氨基酸位点进行了定点突变,然后分析SmHsp47活性的关键位点。
本实验构建了5个SmHsp47基因的突变表达载体,通过对溶壁微球菌的结合、凝集以及抑制活性实验得出以下结论,Leu368和Tyr370的突变能够影响SmHsp47蛋白的可溶性表达,从而增加体外抑菌活性,而Ary209、Asp372、Asp350-Asn366和Arg402-Leu405均不影响SmHsp47蛋白对溶壁微球菌的结合、凝集以及抑制细菌活性。总之,本研究结果表明SmHsp47对革兰氏阳性菌有明显的刺激响应,对溶壁微球菌有明显的凝集与抑菌作用。
1、溶壁微球菌培养基的制备：将添加适量的营养物质、碳源和氮源混合溶解，搅拌均匀，加入适量的水，经加热消毒后，即可得到溶壁微球菌培养基。
2、溶壁微球菌的接种：将溶壁微球菌悬浮液滴入溶壁微球菌培养基中，摇动均匀，加入盖玻片，然后置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的培养。
3、溶壁微球菌的分离：将溶壁微球菌培养液用滤筛分离，收集滤液，再置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的分离。
4、溶壁微球菌的纯化：将溶壁微球菌分离液滴入溶壁微球菌纯化培养基中，摇动均匀，加入盖玻片，然后置于25的恒温箱中，经24小时培养，即可得到溶壁微球菌的纯化。
溶壁微球菌不耐热。微生物菌种应保藏于低温、清洁和干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退。溶壁微球菌具体用于溶菌试验。
三、应用
溶壁微球菌细胞可以用于大菱鲆热休克蛋白Hsp47的功能研究：
以高温胁迫条件下,皮肤转录组测序数据中筛得的热休克蛋白47(HSP47)基因为研究对象,运用细菌结合、凝集及抑制等试验方法对其免疫功能等进行研究,分析HSP47在高温胁迫条件下大量表达的原因,并通过对关键位点的定点突变,高效地分析其所表达的目的蛋白的性状及表征,从而分析HSP47蛋白质结构和功能之间的复杂关系。
大菱鲆热休克蛋白Hsp47对病原相关分子模式的刺激响应。通过RACE技术克隆SmHsp47的c DNA全长1927bp,并进行了生物信息学分析,与其他物种的序列比对显示,分别存在42.76%-81.25%的氨基酸序列一致性。对大菱鲆进行病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns,PAMP)脂多糖(LPS)和磷壁酸(LTA)的刺激,探讨SmHsp47基因对其刺激响应,q PCR实验结果显示,SmHsp47对LTA具有明显的刺激响应。
大菱鲆热休克蛋白Hsp47的免疫相关功能研究。利用已克隆得到的完整SmHsp47基因序列,构建了原核表达载体,经诱导表达,最终鉴定目的蛋白主要以包涵体的形式进行表达,对目的蛋白进行重组复性,得到SmHsp47重组蛋白。对重组蛋白进行了三种丝氨酸蛋白酶抑制活性的研究,结果显示SmHsp47对三种丝氨酸蛋白酶均无抑制活性,属于非抑制型。
利用重组蛋白对细菌进行结合,实验结果显示,SmHsp47与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、鳗弧菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌相互作用,说明SmHsp47可能在细菌攻击期间的免疫防御的方面起作用,可能用于识别入侵细菌;在体外细菌凝菌与抑制活性试验中,SmHsp47重组蛋白特异性的对溶壁微球菌有凝菌及抑菌活性;运用His-pull down技术筛选出在鱼体总蛋白中与SmHsp47相互作用的蛋白,为进一步分析SmHsp47的功能提供参考。
通过定点突变分析氨基酸位点对大菱鲆免疫相关功能的影响。为了了解SmHsp47结构与功能的关系,选取了几个关键的氨基酸位点进行了定点突变,然后分析SmHsp47活性的关键位点。
本实验构建了5个SmHsp47基因的突变表达载体,通过对溶壁微球菌的结合、凝集以及抑制活性实验得出以下结论,Leu368和Tyr370的突变能够影响SmHsp47蛋白的可溶性表达,从而增加体外抑菌活性,而Ary209、Asp372、Asp350-Asn366和Arg402-Leu405均不影响SmHsp47蛋白对溶壁微球菌的结合、凝集以及抑制细菌活性。总之,本研究结果表明SmHsp47对革兰氏阳性菌有明显的刺激响应,对溶壁微球菌有明显的凝集与抑菌作用。