实验中长期保存的表达感受态细胞如何确保其转化活性？

2026-01-24 14:55阅读：

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实验中长期保存的表达感受态细胞如何确保其转化活性？

百欧博伟生物：长期保存表达感受态细胞时，确保其转化活性的核心逻辑是：最大程度减少细胞损伤（物理/化学损伤）、维持细胞膜通透性（感受态关键特征）、抑制细胞代谢与降解酶活性。需从保存前的细胞质量、保存过程中的保护措施、复苏与使用操作三个环节严格把控，具体方法如下：

一、保存前：奠定高活性基础 —— 从细胞制备环节把控

感受态细胞的初始活性直接决定长期保存后的复苏效果，需确保制备过程无缺陷：

1、选择优质宿主菌与培养条件

宿主菌需处于对数生长期中期（OD=0.3-0.5）：此时细胞代谢旺盛、细胞膜流动性强，易被诱导为感受态；若 OD 值过高（进入稳定期），细胞壁厚、活性下降，保存后转化效率会降低 50% 以上。

避免污染：培养过程中严格无菌操作，若细胞被杂菌污染，即使保存条件正确，复苏后也会因杂菌竞争导致目标细胞活性丧失。

2、优化感受态制备缓冲液与抗冻剂

缓冲液：使用含Ca²/Mg²的低渗缓冲液，维持细胞膜稳定性；商业化制备常加入 HEPES、甘油等成分，进一步保护细胞膜结构。

抗冻剂质量：必须使用分子生物学级无菌甘油（终浓度 10%-15%），需提前 121高压灭菌（20 分钟）并冷却至室温；避免使用工业甘油（含杂质如重金属、核酸酶，会破坏细胞活性）。

抗冻剂混匀：加入甘油时需轻柔吹打（用移液器缓慢吸打 5-10 次），不可剧烈振荡（避免细胞膜破裂，导致感受态状态丢失）。

3、分装：单次使用量，避免后续冻融

用无菌 1.5mL 离心管分装，每管体积控制在50-100μL（体积过大时，冷冻/解冻速度慢，易形成大冰晶刺穿细胞膜）。

分装后立即处理（不可室温放置超过 10 分钟），室温会加速细胞代谢，导致感受态活性提前下降。

二、保存中：减少损伤 —— 控制低温环境与稳定性

长期保存的核心是“低温 + 梯度降温”，避免温度波动和冰晶损伤：

1、梯度降温：避免冰晶对细胞的物理破坏

细胞内水分结冰时，若降温过快，会形成大冰晶，刺穿细胞膜和细胞器，导致细胞死亡；梯度降温可形成小冰晶，减少损伤。

标准操作：

分装后先置于-20冰箱预冻 30 分钟（初步降低温度，让细胞逐步适应）；

转入-80冰箱冷冻 2-4 小时（进一步降温，稳定细胞状态）；

若需液氮长期保存（-196），需先在 - 80放置过夜，再转入液氮罐（或使用程序降温盒，以 1/min 速度降至 - 80，效果更优）。

2、稳定低温环境：避免温度波动

-80冰箱：选择“无霜型”（霜层会导致温度波动），存放时避免放在冰箱门架（开关门时温度变化 ±5以上），建议放在冰箱内部靠后的位置（温度最稳定）；定期检查冰箱温度（每周 1 次），避免压缩机故障导致温度升高。

液氮保存：使用专用液氮冻存管（不可用普通离心管，液氮渗入后解冻时会炸裂），冻存管需拧紧盖子（防止液氮进入），并放入液氮罐的“气相区”（比液相区温度更稳定，避免冻存管直接接触液氮导致的温度冲击）；定期补充液氮（确保液面高于冻存管，避免液氮不足导致细胞暴露在高温环境）。

3、标签与记录：避免混淆与过期

每管标注清晰信息：细胞基因型、制备日期、甘油浓度、保存条件。

定期筛选：保存超过 6 个月（-80）或 1 年（液氮）后，可随机抽取 1-2 管进行“活性验证”，若转化效率下降至初始值的 50% 以下，需重新制备。

三、复苏与使用：维持活性 —— 正确解冻与操作

即使保存条件正确，错误的复苏操作也会导致活性丧失，需严格遵循“冰浴解冻 + 快速使用”原则：

1、解冻：冰浴缓慢解冻，避免室温

从 - 80/ 液氮中取出一管，立即放入冰浴（0），解冻时间 5-10 分钟（待管内液体完全融化，无冰晶残留即可）。

严禁室温解冻（室温下细胞快速复苏，代谢突然激活，且细胞膜通透性未稳定，易导致细胞裂解；同时，室温会激活细胞内的核酸酶，降解后续加入的质粒）。

2、使用：快速操作，避免活性丢失

解冻后立即加入质粒（通常 1-5μL 质粒，不可过多，避免质粒中的 EDTA 等成分抑制细胞活性），轻轻混匀后，在冰浴中孵育 20-30 分钟（让质粒充分结合到细胞膜表面，维持感受态状态）。

热激后，需立即放回冰浴 2 分钟（快速降温，让细胞膜恢复完整性，减少质粒泄漏），再加入培养基复苏（37摇床培养 1 小时，让细胞修复损伤并表达抗性基因）。

3、活性验证：定期检测转化效率

若对保存细胞的活性存疑，可通过“阳性对照”验证：取一管细胞，加入已知浓度的标准质粒，按常规转化流程操作，计算转化子数量（每微克质粒形成的菌落数，CFU/μg）。

合格标准：表达感受态细胞的转化效率通常需≥10 CFU/μg；若低于 10 CFU/μg，说明活性已显著下降，不建议用于关键实验。

四、特殊情况：商业化感受态细胞的活性维持

购买的成品感受态细胞，需严格遵循说明书，核心要点：

多数商业化细胞已预加抗冻剂，无需额外处理，直接储存于-80（不可放入 - 20，会导致活性快速下降）；

运输时若用干冰包装，收到后需立即转入 - 80（干冰耗尽后不可室温放置超过 30 分钟）；

保存时间以说明书为准（通常 6-12 个月），超过期限后需做活性验证，不可直接使用。

五、总结：确保转化活性的关键要点

环节核心措施目的

制备前对数期细胞、无菌甘油、轻柔混匀确保初始感受态活性高、细胞膜完整

保存中梯度降温、稳定 - 80/ 液氮环境、避免波动减少冰晶损伤，维持细胞代谢抑制状态

复苏使用冰浴解冻、快速操作、阳性对照验证避免细胞膜破裂，确认活性合格

通过以上步骤，可最大限度维持长期保存的表达感受态细胞的转化活性，确保后续质粒转化、蛋白表达实验的成功率。

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