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小鼠膀胱癌细胞系在生物学研究中具有广泛的应用价值，例如用于研究肿瘤发生和发展的机制、筛选抗肿瘤药物、评估治疗效果等。同时，由于小鼠与人类在生理和病理方面存在一定的相似性，因此小鼠膀胱癌细胞系也被广泛应用于人类肿瘤的研究中。
三、小鼠膀胱癌细胞培养操作
1)复苏小鼠膀胱癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠膀胱癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠膀胱癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
小鼠膀胱癌细胞可以用于猪苓多糖通过诱导自噬抗膀胱癌研究：
研究均一猪苓多糖(homogeneous polyporus polysaccharide,HPP)对膀胱癌细胞自噬的影响,探讨HPP通过调节自噬抗膀胱癌的作用机制,为膀胱癌治疗提供实验数据。
方法：建立BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,成瘤后将小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照吉西他滨(Gemcitabine,Gem)组、HPP低/中/高剂量组,分别给予对应药物腹腔注射。给药期间,每天观察小鼠生命体征等情况,每隔一天称体重,并用游标卡尺测量肿瘤最大径(a)及最小径(b),计算肿瘤体积。给药结束后,取小鼠肿瘤拍照、称重。并采用Western blot检测肿瘤组织中自噬及其相关蛋白Beclin1及p62的表达。
建立模拟体外肿瘤微环境的RAW264.7与小鼠膀胱癌细胞(小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞))共培养模型,将其分为对照组及HPP低、中、高剂量组。共培养24h后,采用细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)实验及5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)实验检测HPP对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖能力的影响。
采用单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)荧光染色实验检测细胞质中自噬体的形成,并采用Western blot检测自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62、LC3B的表达。再采用Western blot检测自噬上游信号通路PI3K/Akt/mTOR蛋白的表达。然后,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA),检测细胞质中自噬体形成的变化、自噬标志蛋白LC3B表达的变化,及小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖能力的变化。
采用Western blot检测小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)在单独培养与共培养细胞模型中自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62的表达情况,并检测HPP单独作用对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62表达的影响。
结果：体内实验结果：
1、与阴性对照组相比,Gem组小鼠体重明显下降(P<0.05),小鼠肿瘤体积和重量无明显变化(P>0.05)。
2、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠体重均呈增加的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。与Gem组相比,HPP各浓度组小鼠体重显著增加(P<0.05)。
3、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠肿瘤体积无明显变化(P>0.05),肿瘤重量呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。
4、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠肿瘤组织中Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05)。
体外实验结果：
1、在共培养细胞模型中,与对照组相比,HPP能抑制小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)的增殖能力(P<0.05),诱导小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)发生自噬,表现为细胞质中自噬体形成增多,且细胞中p62蛋白表达减少(P<0.05),SirT1、Beclin1、LC3B蛋白表达升高(P<0.05)。同时,经HPP处理后,与对照组相比,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)中PI3K/Akt/mTOR信号通路总蛋白及磷酸化蛋白的表达均降低(P<0.05)。加入3-MA后,与HPP组相比,细胞质中自噬体形成减少,LC3B蛋白表达降低(P<0.05),HPP诱导的自噬被抑制,且HPP对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖抑制的效应减弱(P<0.05)。
2、与单独培养相比,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)在共培养细胞模型中自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62的表达无明显变化(P>0.05)。
3、与空白组相比,HPP单独处理后,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)中SirT1、p62蛋白的表达无明显变化(P>0.05),Beclin1蛋白的表达呈上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。
三、小鼠膀胱癌细胞培养操作
1)复苏小鼠膀胱癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠膀胱癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠膀胱癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
小鼠膀胱癌细胞可以用于猪苓多糖通过诱导自噬抗膀胱癌研究：
研究均一猪苓多糖(homogeneous polyporus polysaccharide,HPP)对膀胱癌细胞自噬的影响,探讨HPP通过调节自噬抗膀胱癌的作用机制,为膀胱癌治疗提供实验数据。
方法：建立BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,成瘤后将小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照吉西他滨(Gemcitabine,Gem)组、HPP低/中/高剂量组,分别给予对应药物腹腔注射。给药期间,每天观察小鼠生命体征等情况,每隔一天称体重,并用游标卡尺测量肿瘤最大径(a)及最小径(b),计算肿瘤体积。给药结束后,取小鼠肿瘤拍照、称重。并采用Western blot检测肿瘤组织中自噬及其相关蛋白Beclin1及p62的表达。
建立模拟体外肿瘤微环境的RAW264.7与小鼠膀胱癌细胞(小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞))共培养模型,将其分为对照组及HPP低、中、高剂量组。共培养24h后,采用细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)实验及5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)实验检测HPP对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖能力的影响。
采用单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)荧光染色实验检测细胞质中自噬体的形成,并采用Western blot检测自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62、LC3B的表达。再采用Western blot检测自噬上游信号通路PI3K/Akt/mTOR蛋白的表达。然后,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA),检测细胞质中自噬体形成的变化、自噬标志蛋白LC3B表达的变化,及小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖能力的变化。
采用Western blot检测小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)在单独培养与共培养细胞模型中自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62的表达情况,并检测HPP单独作用对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62表达的影响。
结果：体内实验结果：
1、与阴性对照组相比,Gem组小鼠体重明显下降(P<0.05),小鼠肿瘤体积和重量无明显变化(P>0.05)。
2、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠体重均呈增加的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。与Gem组相比,HPP各浓度组小鼠体重显著增加(P<0.05)。
3、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠肿瘤体积无明显变化(P>0.05),肿瘤重量呈下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。
4、与阴性对照组相比,HPP各浓度组小鼠肿瘤组织中Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),p62蛋白表达降低(P<0.05)。
体外实验结果：
1、在共培养细胞模型中,与对照组相比,HPP能抑制小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)的增殖能力(P<0.05),诱导小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)发生自噬,表现为细胞质中自噬体形成增多,且细胞中p62蛋白表达减少(P<0.05),SirT1、Beclin1、LC3B蛋白表达升高(P<0.05)。同时,经HPP处理后,与对照组相比,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)中PI3K/Akt/mTOR信号通路总蛋白及磷酸化蛋白的表达均降低(P<0.05)。加入3-MA后,与HPP组相比,细胞质中自噬体形成减少,LC3B蛋白表达降低(P<0.05),HPP诱导的自噬被抑制,且HPP对小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)增殖抑制的效应减弱(P<0.05)。
2、与单独培养相比,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)在共培养细胞模型中自噬相关蛋白SirT1、Beclin1、p62的表达无明显变化(P>0.05)。
3、与空白组相比,HPP单独处理后,小鼠膀胱癌细胞(MB49细胞)中SirT1、p62蛋白的表达无明显变化(P>0.05),Beclin1蛋白的表达呈上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。