细胞培养基的准备工作、配制与使用方法及后续处理！

2026-02-28 15:57阅读：

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细胞培养基的准备工作、配制与使用方法及后续处理！

细胞培养基的使用核心是严格遵循无菌操作和匹配细胞需求，从解冻、配制到使用后处理，每一步都直接影响细胞的生长状态和实验结果。

正确使用细胞培养基需遵循“准备 - 配制 - 使用 - 后续处理”的流程，同时要特别注意无菌环境、成分匹配和储存条件这三个关键要素。

一、使用前准备：核心是“无菌”与“匹配”

在开始操作前，必须完成两项基础工作，避免后续污染或细胞不适应。

1、确认培养基类型与细胞匹配

不同细胞（如贴壁细胞、悬浮细胞、干细胞）对营养的需求差异极大，必须选择对应的培养基。

贴壁细胞（如 HeLa 细胞）：常用DMEM 培养基，部分需要添加高糖。

悬浮细胞（如 Jurkat 细胞）：常用RPMI-1640 培养基。

特殊细胞（如胚胎干细胞）：需使用专用的干细胞培养基，并添加特定细胞因子。

关键检查：核对培养基名称、批号、有效期，确认是否需要额外添加成分（如血清、抗生素、谷氨酰胺）。

2、准备无菌操作环境与工具

环境：在生物安全柜内进行所有操作，提前 30 分钟打开紫外灯消毒，操作前用 75% 酒精擦拭台面。

工具：移液器、离心管、培养皿等需灭菌，瓶口开启后用酒精灯火焰快速过一下（避免长时间灼烧）。

试剂：将培养基、血清等从冰箱取出，在室温下放置 20-30 分钟（或在 37水浴锅快速解冻，避免反复冻融），待温度回升至室温后再使用。

二、培养基配制：分“基础型”和“添加型”

大部分商用培养基为“基础培养基”，需根据细胞需求添加补充成分，常见两种配制场景：

1、基础培养基（无需添加成分）

直接从储存条件（通常 2-8冷藏）取出，待温度恢复至室温后，轻轻颠倒混匀 3-5 次（避免剧烈摇晃产生过多气泡，气泡会影响细胞贴壁）。

若发现培养基出现浑浊、沉淀、颜色异常（如 pH 值异常导致的变黄或变紫），则不可使用。

2、需添加补充成分的培养基（最常用）

以“基础培养基 + 胎牛血清（FBS）+ 抗生素”的经典组合为例，步骤如下：

取无菌离心管，按比例加入基础培养基（如 89mL）。

加入血清（通常终浓度 10%，即 10mL 胎牛血清），轻轻吹打混匀（避免血清挂壁浪费）。

加入抗生素（如青霉素 - 链霉素混合液，终浓度 1%，即 1mL），再次混匀。

配制完成后，可取样检测 pH 值（正常细胞培养基 pH 通常为 7.2-7.4，颜色呈淡红色或桃红色），若 pH 偏酸（变黄），可滴加少量无菌的 NaHCO溶液调节；若偏碱（变紫），可通入少量无菌 CO。

配制好的完全培养基需在 2-8冷藏保存，且保存时间不超过 2 周（避免成分降解），使用前需再次混匀。

三、培养基使用：分“细胞接种”和“换液”场景

1、细胞接种（新细胞培养或传代时）

准备好待接种的细胞悬液（传代时需先消化、离心收集细胞），调整细胞浓度至合适范围（如 1×10 - 1×10 cells/mL，具体浓度根据细胞类型调整）。

向培养皿 / 培养瓶中加入配制好的完全培养基（如 6 孔板每孔加 2-3mL，T25 培养瓶加 5-8mL）。

按比例加入细胞悬液（如 6 孔板每孔加入 1mL 细胞悬液），轻轻摇晃培养皿 / 瓶，使细胞均匀分布（避免细胞聚集在中心）。

将培养皿 / 瓶放入 37、5% CO的细胞培养箱中，静置培养（贴壁细胞需培养 24 小时左右才能完全贴壁，期间尽量不移动培养箱）。

2、细胞换液（细胞培养过程中）

目的：去除细胞代谢产生的废物（如乳酸），补充新鲜营养，维持细胞生长环境稳定。

频率：通常贴壁细胞每 2-3 天换液一次，悬浮细胞每 1-2 天换液一次（具体根据细胞密度和培养基颜色判断，若培养基变黄则需及时换液）。

步骤：

从培养箱中取出培养皿 / 瓶，在生物安全柜内操作。

贴壁细胞：轻轻倾斜培养皿，用移液器吸走旧培养基（注意吸头不要触碰细胞层，避免损伤细胞）。

悬浮细胞：先将培养瓶中的细胞悬液转移至无菌离心管，1000-1500rpm 离心 5 分钟，弃去上清旧培养基，加入新鲜培养基重悬细胞后，再转移回培养瓶。

向培养皿 / 瓶中加入新鲜的完全培养基，放回培养箱继续培养。

四、使用后处理：避免污染与浪费

1、剩余培养基处理

未开封的培养基：按说明书要求储存（2-8冷藏或 - 20冷冻），避免阳光直射。

已开封的基础培养基：2-8冷藏，1 个月内使用完毕，每次使用后及时拧紧瓶盖。

已配制的完全培养基：2-8冷藏，2 周内使用完毕，不可反复冻融。

2、污染处理

若发现培养基浑浊、出现白色 / 绿色絮状物（细菌或真菌污染），需立即停止使用，将污染的培养物、培养基等放入专用医疗废弃物袋，按生物安全规范处理（不可直接倒入下水道）。

污染后的操作工具需用 121高压蒸汽灭菌 30 分钟，生物安全柜需重新消毒（用含氯消毒剂擦拭后再开紫外灯）。

3、器具清洗

用过的培养皿、离心管等一次性器具，需放入医疗废弃物专用容器；可重复使用的玻璃器具，需先浸泡在含氯消毒剂中 30 分钟，再用清水冲洗干净，烘干后灭菌备用。

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