原代培养的大鼠脉络膜成纤维细胞在培养过程中需要注意什么？
2026-01-09 15:58阅读：
原代培养的大鼠脉络膜成纤维细胞在培养过程中需要注意什么？
原代培养的大鼠脉络膜成纤维细胞因直接来源于活体组织，细胞状态更接近体内生理特性，但也具有分离难度高、对外界环境敏感、易污染、增殖能力有限等特点，培养过程中需精准控制各环节以保证细胞活性、纯度和功能稳定性。以下是关键注意事项，按“前期准备
- 分离操作 - 培养维护 - 质量监控 - 特殊风险”分类说明：
一、前期准备：无菌与试剂适配是基础
原代细胞对污染和试剂兼容性极敏感，前期准备需杜绝所有潜在风险：
1、无菌环境控制
操作需在生物安全柜（二级及以上） 内进行，提前 30 分钟开启紫外消毒（≥20 分钟），操作前用 75% 乙醇擦拭台面、器械及操作者双手 /
手套。
所有接触细胞的耗材（培养皿、离心管、移液管、枪头）需为无酶、无菌、无内毒素规格，避免残留化学物质或酶类损伤细胞（如胰蛋白酶残留会导致细胞贴壁困难）。
培养箱需定期（每周 1 次）用 75%
乙醇擦拭内壁，或用紫外消毒（关闭培养箱后进行），并监测 CO浓度（稳定在
5%）和温度（37±0.5），避免频繁开关导致环境波动。
2、试剂选择与预温
培养基：需使用成纤维细胞专用培养基，添加 10%-15%
胎牛血清（FBS，需筛选无支原体、低内毒素批次，避免血清质量差异导致细胞生长异常）、1% 青霉素 -
链霉素（双抗，抑制细菌污染），可额外添加 5ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进增殖。
消化液：选择 0.25% 胰蛋白酶 -
EDTA（1:1），避免使用浓度过高或消化时间过长的胰酶（会破坏细胞表面蛋白）；消化前需将胰酶和培养基37预温 10-15
分钟，避免冷试剂刺激细胞导致应激损伤。
缓冲液：使用无菌的 D-Hank’s 液或 PBS（不含
Ca²、Mg²，避免影响胰酶活性），用于冲洗组织和终止消化。
二、组织分离与细胞接种：减少损伤，保证纯度
原代 CFs
的分离质量直接决定后续培养效果，需注意以下细节：
1、组织取材与处理
选择健康大鼠（如 SPF 级 SD 大鼠，6-8
周龄，避免老年大鼠组织纤维化严重导致细胞活性低），处死后勤快取出眼球，用 75% 乙醇快速擦拭眼球表面（≤30
秒，避免乙醇渗透损伤脉络膜），再用无菌 D-Hank’s 液冲洗 3 次。
在解剖显微镜下小心剥离脉络膜（避免混入视网膜、巩膜组织，这些组织中的细胞会污染
CFs，如视网膜色素上皮细胞会与 CFs 竞争生长），将脉络膜剪成 1mm³ 以下的小块（组织块越小，细胞越易迁出），用
D-Hank’s 液冲洗 2-3 次去除残留血液和杂质。
2、消化与接种技巧
消化时将组织块加入预温的胰酶，37孵育 15-20 分钟，期间每隔 5
分钟轻轻震荡 1 次，观察组织块边缘是否变模糊（避免过度消化导致细胞裂解）；消化后立即加入 2-3
倍体积的含血清培养基终止胰酶活性，用吸管轻轻吹打组织块（力度适中，避免产生气泡损伤细胞），使细胞分散。
用 200
目细胞筛过滤细胞悬液（去除未消化的组织碎片，减少杂质污染），1000rpm 离心 5
分钟（低速离心避免细胞破裂），弃上清后用新鲜培养基重悬细胞，计数后按1×10-2×10个细胞
/cm²的密度接种（密度过低易导致细胞贴壁困难，密度过高易出现接触抑制），接种后轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分布，放入培养箱静置 24
小时（期间不移动培养皿，保证细胞充分贴壁）。
三、培养维护：精准控制环境，避免污染与应激
原代 CFs
贴壁后需精细化维护，重点关注“换液、传代、污染防控”：
1、换液频率与操作
接种后24-48
小时首次换液：此时细胞已初步贴壁，需弃去未贴壁的死细胞、残留胰酶和组织碎片，加入新鲜培养基（避免旧培养基中积累的代谢废物抑制细胞生长）。
后续换液：根据培养基颜色变化（当培养基由红色变为橙黄色，提示 pH
下降、代谢废物增多），每 2-3 天换液 1 次；换液时用无菌 PBS 轻轻冲洗细胞表面 1
次（避免直接冲淋细胞导致脱落），加入培养基时沿培养皿壁缓慢注入（避免产生水流冲击细胞）。
2、传代时机与方法
传代时机：当细胞融合度达到 70%-80%
时进行传代（避免融合度过高导致接触抑制，细胞停止增殖），原代 CFs 通常培养 5-7 天达到传代标准，且传代次数有限（一般不超过 5
代，超过后细胞易出现衰老、形态改变或功能丧失）。
传代操作：弃去培养基，加入预温的胰酶覆盖细胞表面，37孵育 3-5
分钟，在显微镜下观察到细胞收缩变圆、间隙增大时，立即加入培养基终止消化；用吸管轻轻吹打细胞（从培养皿边缘向中心螺旋式吹打，避免遗漏角落细胞），制成单细胞悬液后按
1:2 或 1:3 的比例接种到新培养皿（传代比例过高会导致细胞密度过低，生长缓慢）。
3、污染防控重点
支原体污染：支原体是原代细胞最常见的隐性污染（肉眼不可见，会抑制细胞增殖、改变细胞功能），需每 2
周用支原体检测试剂盒检测 1
次；若发现污染，需立即丢弃污染细胞（支原体难以彻底清除，避免交叉污染其他细胞），并对培养箱、耗材进行彻底消毒。
细菌 / 真菌污染：若培养基出现浑浊（细菌污染）或白色 /
黑色斑点（真菌污染），需立即将污染细胞移出培养室，用含 2%
次氯酸钠的溶液擦拭培养箱内壁，并用无菌空气净化培养箱；日常操作中避免将瓶口长时间暴露，移液时枪头不触碰瓶口和台面。
细胞交叉污染：不同细胞系（如同时培养视网膜细胞）需分开操作，使用专用的耗材和试剂，避免共用移液枪或培养皿导致交叉污染。
四、质量监控：确保细胞纯度与功能
原代 CFs
需通过检测确认纯度和活性，避免杂细胞影响实验结果：
1、细胞形态观察
每日在倒置显微镜下观察细胞形态：正常 CFs
呈长梭形或多边形，贴壁生长，排列呈“漩涡状”；若出现圆形细胞增多（细胞凋亡）、形态不规则（应激损伤）或杂质细胞（如上皮细胞呈多边形、紧密排列），需分析原因（如血清质量、污染、消化过度）并及时调整。
2、纯度鉴定
采用免疫荧光染色检测成纤维细胞特异性标志物：波形蛋白阳性（成纤维细胞标志物），角蛋白阴性（上皮细胞标志物）、CD31
阴性（血管内皮细胞标志物），确保 CFs 纯度≥95%（杂细胞过多会干扰实验结果，如研究 CFs
在脉络膜新生血管中的作用时，内皮细胞污染会导致结果误判）。
3、活性与功能检测
用台盼蓝染色法检测细胞活性（活性≥90% 为合格）；若需用于功能实验（如细胞因子分泌、增殖能力检测），需在传代 2-3
代时进行（此时细胞状态最佳，衰老细胞少），避免使用传代次数过多的细胞。
五、特殊注意事项
避免频繁操作：原代 CFs
对环境变化敏感，避免频繁观察或移动培养皿（会导致温度波动和细胞震动，影响贴壁和增殖）。
冻存与复苏：若需长期保存，需在细胞融合度 70%-80%
时冻存（冻存液为培养基：FBS:DMSO=7:2:1，DMSO 需缓慢加入避免细胞毒性），-80保存≤1
个月，长期需转入液氮；复苏时快速 37水浴融化（1-2 分钟），立即加入培养基稀释
DMSO，离心后重悬接种（复苏后细胞活性会下降，需额外添加 bFGF 促进恢复）。
实验记录：详细记录每一步操作（如大鼠品系、取材时间、血清批次、传代次数、检测结果），便于追溯实验差异的原因。
总之，原代大鼠脉络膜成纤维细胞的培养核心是“无菌环境 + 温和操作 +
精准监控”，需从试剂、操作、环境等多维度减少细胞损伤和污染，才能保证细胞的纯度、活性和功能稳定性，为后续的眼部生理（如脉络膜结构维持）或病理（如脉络膜新生血管）研究提供可靠的细胞模型。
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