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厌氧菌分离培养标准操作流程中需要关注的注意事项有哪些?

2026-01-09 16:05阅读:
厌氧菌分离培养标准操作流程中需要关注的注意事项有哪些?



百欧博伟生物:厌氧菌分离培养的成功与否高度依赖对“无氧环境”“标本质量”和“操作细节”的把控,以下是标准操作流程中需特别关注的注意事项,涵盖全流程关键控制点:

一、厌氧环境维持的注意事项

1、环境参数的实时监控

厌氧工作站需每日监测气体比例(85% N+10% H+5% CO)和温度(35-37),若 H浓度不足(<8%),需及时补充,避免催化剂(钯)失效(表现为亚甲蓝指示剂变蓝)。

厌氧罐使用前需检查:产气包是否在有效期内,催化剂是否受潮(受潮会失去除氧能力,可 160干烤 2 小时复活),密封是否严密(倒置 10 秒无气体泄漏)。

避免频繁开关工作站门:每次开门时间≤30 秒,开门后需等待 30 分钟,待气体重新平衡、氧浓度 < 0.1% 后再操作,防止短期氧暴露影响细菌活性。

2、培养基的预还原与保存
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预还原后的培养基需在厌氧环境中保存,有效期≤7 天(超过则可能重新氧化,表面形成氧化层),使用前观察颜色:含还原剂的培养基若变为浅棕色,提示氧化,需重新处理。

倾注平板时避免产生气泡:气泡内的氧气会局部破坏无氧环境,倒平板后需在工作站内静置 30 分钟,待琼脂凝固且表面无气泡后使用。

二、标本采集与转运的禁忌与要点

1、绝对避免的错误采集方式

不可用棉签采集标本:棉签纤维易吸附氧气,且无法有效隔绝空气,导致厌氧菌在转运中失活(尤其对氧敏感的普雷沃菌、梭杆菌)。

穿刺液标本不可先注入普通试管再转移:普通试管无还原环境,标本接触空气时间 > 5 分钟即可能导致脆弱类杆菌等严格厌氧菌死亡。

2、转运中的“时间与温度”红线

标本从采集到进入实验室厌氧环境的总时间必须≤2 小时:超过则需记录延迟原因,结果解读时需考虑厌氧菌活性下降的影响。

严禁冷藏(4)或冷冻(-20)转运:低温会抑制厌氧菌的代谢酶活性,尤其对放线菌、双歧杆菌等影响显著,室温(20-25)是唯一可选条件。

三、实验室操作的细节规范

1、接种环节的“防氧”要求

液体标本离心时需用密封离心管:普通试管离心会导致空气混入沉淀,需在工作站内打开离心管,避免离心后暴露氧气。

组织标本研磨需在预还原生理盐水中进行:研磨过程会产生气泡,需在工作站内操作,研磨后立即接种(不可放置超过 10 分钟)。

2、培养观察的“无氧原则”

观察菌落必须在工作站内进行:禁止将平板移出工作站查看(即使短暂暴露,也可能导致边缘菌落因氧暴露死亡),可通过工作站观察窗记录形态。

延长培养的平板需补充水分:培养超过 7 天时,培养基易干燥,需在工作站内用无菌滴管滴加少量预还原生理盐水(每平板 3-5 滴),避免菌落干裂。

四、质量控制与安全的核心要点

1、阳性对照的必要性

每批次实验需同步接种标准菌株:如脆弱类杆菌(ATCC 25285)和产气荚膜梭菌(ATCC 13124),若对照菌株不生长,需排查培养基质量、厌氧环境是否达标(优先检查催化剂活性和气体比例)。

2、生物安全的特殊要求

处理破伤风梭菌、肉毒梭菌等致病性厌氧菌时,需在生物安全柜内完成标本开封(再移入工作站),避免芽胞气溶胶污染。

废弃标本需高压灭菌 2 次:首次灭菌后可能因芽胞未被杀灭复活,需间隔 2 小时再次灭菌(121,30 分钟),确保彻底灭活。

总结:厌氧菌分离培养的核心是构建“全程无氧链”,任何环节的氧暴露(即使几秒)或操作不规范(如标本污染、培养基氧化)都可能导致培养失败。严格遵循上述注意事项,可显著提高厌氧菌的分离率和鉴定准确性。

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