原代细胞复苏过程中的常见问题与原因分析及对应处理方案！

2026-01-20 15:10阅读：

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原代细胞复苏过程中的常见问题与原因分析及对应处理方案！

百欧博伟生物：原代细胞复苏是将冻存的原代细胞恢复活性并重新培养的关键步骤，由于原代细胞本身分离自活体组织、增殖能力较弱且对环境变化更敏感，复苏过程中易出现多种问题。以下是常见问题、原因分析及对应处理方案，按问题发生频率和影响程度排序：

一、细胞活力极低（复苏后活细胞占比＜50%）

这是原代细胞复苏最核心的问题，直接导致后续培养失败，需优先排查。

常见原因：

冻存环节遗留问题：冻存时细胞密度过低（＜1×10 cells/mL）、冻存液配方不当（如 DMSO 浓度过高 / 过低，或未加血清保护）、冻存速度不符合“梯度降温”原则（如直接放入 -80 或液氮，未用程序降温盒）。

复苏操作不当：解冻速度过慢（如在室温下长时间融化）、解冻后未及时去除高浓度 DMSO（DMSO 对细胞有化学毒性，室温下毒性增强）。

细胞储存问题：液氮罐液位不足（细胞长期处于

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处理方案：

优化解冻操作：必须快速解冻—— 将冻存管直接放入 37 恒温水浴锅，轻轻摇晃至仅剩“黄豆大小”的冰晶（约 1-2 分钟），立即取出（避免过度加热损伤细胞）。

及时稀释 DMSO：解冻后立即将细胞悬液缓慢加入预温至 37 的完全培养基中（培养基体积是冻存液的 5-10 倍，如 1mL 冻存液加 5-10mL 培养基），轻轻吹打混匀，降低 DMSO 浓度至安全范围（＜1%）。

离心洗涤：200-300×g 离心 5-8 分钟（转速过高易损伤原代细胞），弃上清（彻底去除残留 DMSO），用新鲜完全培养基重悬细胞后接种。

追溯冻存环节：若多次复苏活力低，需检查冻存流程 —— 原代细胞冻存密度建议 1×10 - 5×10 cells/mL，冻存液常用“90% 胎牛血清 + 10% DMSO”（部分敏感细胞可用无血清冻存液），冻存时需用程序降温盒（-1/min 降温至 -80），24 小时内转入液氮。

二、细胞污染（细菌、真菌、支原体）

原代细胞因分离过程接触活体组织，本身携带污染风险，复苏操作中若无菌控制不当，污染会快速爆发。

常见类型及原因：

污染类型典型特征主要原因

细菌污染复苏后 24-48 小时培养基浑浊，显微镜下见大量快速运动的微小颗粒水浴锅污染、培养基 / 离心管无菌失效、操作时未严格无菌

真菌污染培养基表面出现白色/黄色绒毛状菌落，后期培养基浑浊环境中真菌孢子污染（如超净台未紫外线消毒、操作人员衣物带菌）

支原体污染培养基澄清，细胞生长缓慢、形态异常，常规显微镜下难观察冻存前细胞已携带支原体、操作中交叉污染（如移液器共用）

处理方案：

细菌 / 真菌污染：

若污染早期（仅少量污染，细胞形态未严重改变）：可加入抗生素（细菌用青霉素 - 链霉素双抗，真菌用两性霉素 B，浓度需参考细胞耐受范围，如双抗 100U/mL），培养 24-48 小时后更换新鲜培养基，观察污染是否控制；

若污染严重（培养基完全浑浊）：直接丢弃细胞（避免污染扩散至其他细胞），并对培养箱、超净台用含氯消毒剂擦拭消毒，水浴锅加入硫酸铜（0.1% 浓度）抑菌。

支原体污染：

复苏后需定期用支原体检测试剂盒（如 PCR 法、荧光染色法）筛查；

若确诊污染：可使用支原体清除试剂（如支原体去除液）处理 1-2 个培养周期，或丢弃细胞（原代细胞支原体清除难度高，优先选择丢弃以避免后续实验误差）。

三、细胞贴壁困难（贴壁类原代细胞）

原代细胞（如肝细胞、成纤维细胞、上皮细胞）多为贴壁生长，复苏后若无法正常贴壁，会导致细胞死亡或生长停滞。

常见原因：

培养皿 / 瓶表面处理不当：原代细胞对贴壁基质需求高，普通塑料培养皿未包被基质（如胶原蛋白、多聚赖氨酸），导致细胞无法附着。

复苏后离心操作不当：离心转速过高（＞500×g）或离心时间过长（＞10 分钟），损伤细胞表面贴壁相关蛋白。

培养基成分不合适：如血清浓度过低（原代细胞需 10%-20% 胎牛血清，低于 5% 会影响贴壁）、未添加贴壁辅助因子。

处理方案：

预处理培养容器：复苏前用 0.1% 多聚赖氨酸或鼠尾胶原蛋白包被培养皿 / 瓶（37 孵育 30 分钟，弃去多余液体后使用），增强细胞贴壁能力。

优化离心参数：采用低转速离心（200-300×g，5-8 分钟），离心后轻柔重悬细胞（避免吹打过度损伤细胞）。

调整培养基配方：使用含 15%-20% 优质胎牛血清的完全培养基，必要时添加细胞专用生长因子，接种后将培养箱温度稳定在 37、CO 浓度 5%，避免温度波动影响贴壁。

减少早期干扰：细胞接种后 24 小时内不移动培养皿（避免液体流动导致未贴壁细胞脱落），24 小时后再观察贴壁情况，若贴壁率低，可更换新鲜培养基（去除死亡细胞碎片）。

四、细胞生长缓慢或停滞

复苏后细胞存活但增殖速度远低于预期（如原代成纤维细胞正常 2-3 天传代，复苏后 5-7 天仍未达到传代密度），甚至出现生长停滞。

常见原因：

细胞老化或分化：原代细胞分裂能力有限（传代次数通常＜10 代），若冻存的是晚期传代细胞，复苏后易进入衰老期，生长能力下降。

培养环境不适：CO 浓度异常（过高＞6% 导致培养基 pH 过低，过低＜4% 导致 pH 过高）、培养箱内湿度不足（导致培养基蒸发过快，渗透压升高）。

营养缺乏或代谢废物积累：复苏后未及时更换培养基（细胞代谢产生的乳酸、氨等废物抑制生长），或培养基储存不当（如反复冻融导致营养成分降解）。

处理方案：

选择早期传代细胞冻存：复苏前确认冻存细胞的传代次数（优先选择 P2-P4 代的原代细胞冻存，活力和增殖能力更强）。

校准培养环境：定期校准 CO 培养箱的温度和 CO 浓度（确保温度 37±0.5，CO 5±0.5%），培养箱内放置无菌水盘维持湿度（避免培养基蒸发）。

及时更换培养基：复苏后 24 小时更换一次新鲜完全培养基（去除死亡细胞碎片和残留 DMSO），后续根据细胞密度 2-3 天换液一次，确保营养充足。

五、细胞形态异常（如细胞变圆、聚团、皱缩）

原代细胞形态具有组织特异性（如上皮细胞呈多边形、成纤维细胞呈梭形），复苏后形态异常通常提示细胞受损或环境不适，若不及时调整会导致细胞死亡。

常见原因：

冻融损伤：解冻速度过慢或冻存液中 DMSO 浓度过高（＞15%），导致细胞内形成冰晶，破坏细胞膜和细胞器。

渗透压失衡：解冻后细胞悬液直接加入室温培养基（未预温），或培养基中血清 / 盐浓度异常，导致细胞脱水或吸水膨胀。

污染早期：支原体污染或低浓度细菌污染，早期未出现培养基浑浊，但已导致细胞代谢紊乱，形态改变。

处理方案：

避免冻融损伤：严格遵循“快速解冻 + 梯度稀释 DMSO”原则（如前文所述），敏感原代细胞（如肝细胞、神经细胞）可使用无 DMSO 冻存液，降低化学损伤。

维持渗透压稳定：培养基需提前 30 分钟放入 37 水浴锅预温，确保与细胞温度一致；复苏时细胞悬液与培养基混合需缓慢（1 滴 / 秒），避免渗透压骤变。

排查污染与环境：若形态异常伴随生长缓慢，优先检测支原体和隐性细菌污染；同时检查培养基 pH（正常为 7.2-7.4，过酸呈黄色、过碱呈紫色），若 pH 异常需更换新鲜培养基或校准 CO 浓度。

总结：原代细胞复苏的关键原则

为减少上述问题，需牢记“快解冻、慢稀释、低离心、严无菌、适环境”15 字原则：

快解冻：37 水浴 1-2 分钟，避免冰晶损伤；

慢稀释：冻存液与预温培养基缓慢混合，降低 DMSO 毒性；

低离心：200-300×g 离心 5-8 分钟，保护细胞活性；

严无菌：全程无菌操作，复苏后定期筛查污染；

适环境：优化培养基配方、贴壁基质和培养箱参数，匹配原代细胞的生长需求。

若多次复苏失败，建议追溯冻存前细胞状态（如冻存前是否进行活率检测），或重新分离原代细胞（避免使用长期储存的低活力冻存细胞）。

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