小鼠原代结肠成纤维细胞的培养操作要点及鉴定方法！
2026-01-22 15:18阅读：
小鼠原代结肠成纤维细胞的培养操作要点及鉴定方法！
小鼠原代结肠成纤维细胞是分离自小鼠结肠组织（多分布于粘膜下层及外膜结缔组织中）的贴壁生长细胞，呈典型梭形，是结肠间质的核心细胞之一，在组织稳态、损伤修复、炎症与肿瘤发生发展中扮演关键角色，是肠道相关基础与转化研究的常用模型。
一、核心特征
形态与生长：典型成纤维样，贴壁生长，呈长梭形或多角形，汇合后呈漩涡状排列。刚分离时为圆形，30
分钟内开始贴壁，6 小时左右可完全贴壁伸展。
分子标志物：波形蛋白（Vimentin）、纤维连接蛋白（Fibronectin）为经典阳性标志物；在特定刺激下可活化，表达
α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA），转变为肌成纤维细胞或癌相关成纤维细胞（CAFs）。
二、核心功能
结构支撑：分泌胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质（ECM），维持结肠壁结构稳定。
修复与再生：参与肠道损伤后的创面愈合，过度活化则易导致纤维化。
免疫与微环境调控：分泌细胞因子、趋化因子，调控炎症反应；在肿瘤微环境中可转化为 CAFs，促进肿瘤增殖、侵袭与转移。
质控指标：商用细胞常要求纯度≥90%，无支原体、细菌、真菌等污染，无 HIV-1、HBV、HCV
等外源病毒。
三、常规培养与操作要点
培养条件：37、5% CO、饱和湿度培养箱；常用培养基为
DMEM/F12 加 10% 胎牛血清（FBS）与双抗，也可使用专用原代成纤维细胞培养基以提升稳定性。
四、传代与冻存
传代：当细胞汇合度达 80%-90% 时，用 0.25% 胰酶 -
EDTA 消化传代，传代比例常为 1:2 - 1:3，避免过度汇合导致细胞老化。
冻存：采用 90% FBS + 10% DMSO
作为冻存液，程序降温后置于液氮长期保存；短期可暂存于 - 80（建议不超过 1 个月）。
分离方法（简版）：无菌取小鼠结肠组织→去除黏膜上皮层（酶解 +
机械刮除）→剪碎组织块→胶原酶/胰酶联合消化→过滤→离心收集细胞→接种培养→差速贴壁去除杂细胞，获得纯化的成纤维细胞。
五、鉴定方法
免疫荧光/免疫组化：检测 Vimentin、Fibronectin
阳性率，α-SMA 可用于评估活化状态。
Western Blot/RT-PCR：定量检测上述标志物的蛋白或 mRNA 水平。
形态学与生长曲线：辅助判断细胞纯度与活性。
六、常见应用场景
肠道炎症性疾病的病理机制研究。
结肠纤维化的发生机制与药物干预筛选。
结直肠癌微环境研究，尤其是 CAFs
的诱导、功能及靶向策略探索。
细胞外基质重塑、细胞间相互作用研究。
七、常见问题与对策
杂细胞污染：上皮细胞、免疫细胞等混杂是常见问题，可通过差速贴壁、酶解梯度优化、使用专用培养基及免疫磁珠分选等方式富集纯化。
细胞老化/增殖缓慢：控制传代次数（原代细胞建议传代不超过 5-8
代），避免过度汇合，保证血清质量，维持稳定的培养环境。
自发活化：体外培养易导致细胞自发活化，需严格控制培养条件，设置空白对照，用于 CAFs
研究时则可通过肿瘤细胞条件培养基等方式诱导活化。
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