乳酸杆菌选择性培养基的实验步骤及操作要点与质量控制！
2026-01-22 16:00阅读：
乳酸杆菌选择性培养基的实验步骤及操作要点与质量控制！
乳酸杆菌选择性培养基的实验步骤需遵循“培养基制备→样品处理→接种培养→结果观察与鉴定”的核心流程，以最常用的培养基为例，结合标准化操作（SOP）、质量控制要点和关键注意事项，详细步骤如下：
一、实验前准备（确保无菌与试剂有效性）
1、试剂与器材准备
类别
具体内容
培养基成分 蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二铵、MgSO?7HO、MnSO?4HO、吐温
80、CaCO、琼脂、蒸馏水（均为分析纯）
辅助试剂 生理
盐水（0.85% NaCl）、厌氧包（或 CO产气包）、革兰氏染色液、过氧化氢酶试剂（3% HO）
器材 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、厌氧罐（或 CO培养箱）、恒温培养箱（35-37）、电子天平、pH
计、移液管（1mL、10mL）、培养皿、锥形瓶、酒精灯、接种环等
2、实验环境与无菌要求
超净工作台提前 30
分钟开启紫外消毒，实验人员穿戴无菌手套、口罩、实验服；
所有器材（培养皿、移液管、锥形瓶等）需 121高压灭菌 15-20
分钟，冷却后备用；
试剂开封后需标注有效期，避免污染（如
CaCO易吸潮，需密封保存）。
二、核心实验步骤
步骤 1：培养基制备（1L
配方，可按比例缩放）
称量与溶解：在锥形瓶中加入 1000mL 蒸馏水，依次加入蛋白胨
10g、牛肉膏 10g、酵母提取物 5g、葡萄糖 20g、乙酸钠 5g、柠檬酸二铵 2g、MgSO?7HO
0.58g、MnSO?4HO
0.25g，搅拌至完全溶解（可小火加热辅助溶解，但避免温度过高导致葡萄糖碳化）。
调节 pH：加入吐温 80 1mL（充分搅拌均匀），用 pH 计检测
pH，用 1mol/L HCl 或 1mol/L NaOH 调至 6.2-6.4（灭菌后 pH 会略有下降，需预留 0.1-0.2
的缓冲空间）。
添加凝固剂与鉴别成分：加入琼脂
15-20g（固体培养基），搅拌均匀；再加入 CaCO
15-20g（轻轻搅拌，避免剧烈搅拌产生气泡，影响菌落观察）。
灭菌：将锥形瓶用双层纱布封口（或用硅胶塞），放入高压蒸汽灭菌锅，121、103.4kPa 灭菌 15-20
分钟（灭菌时间过长会破坏营养成分，过短则灭菌不彻底）。
倒平板：灭菌后取出锥形瓶，待培养基冷却至
50-60（手感不烫手）时，在超净工作台中倒入无菌培养皿（每皿约
20mL），轻轻晃动培养皿使培养基均匀分布，避免产生气泡。
凝固与储存：将平板水平放置在超净工作台中，待培养基完全凝固（约 30
分钟）后，倒置储存于 4冰箱（避免冷凝水滴落污染培养基表面），保质期不超过 1 周。
步骤
2：样品处理（以粪便、发酵食品为例）
样品稀释：
称取 1g 样品（如粪便、酸奶），放入含 9mL
无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡 10 分钟（或用匀浆器匀浆），制成 10¹ 稀释液；
用无菌移液管吸取 1mL 10¹ 稀释液，注入含 9mL
无菌生理盐水的锥形瓶中，振荡均匀，制成 10² 稀释液；
依次梯度稀释至
10³-10（根据样品中乳酸杆菌含量调整，粪便样品可稀释至 10，发酵食品可稀释至 10³）。
样品接种：
选择 3 个连续稀释度（如 10、10、10），用无菌移液管各吸取
0.1mL 稀释液，分别滴加在 MRS-CaCO平板表面；
用无菌涂布棒（蘸取酒精后在酒精灯外焰灼烧灭菌，冷却后使用）将稀释液均匀涂布在培养基表面，确保菌液覆盖整个平板（避免局部菌落过密）。
阴性对照设置：同时设置空白对照（仅接种无菌生理盐水的平板）和阴性对照（接种已知非乳酸杆菌菌株的平板，如大肠杆菌），用于验证培养基的选择性和无菌性。
步骤 3：培养
厌氧环境构建：
方法 1：将接种后的平板放入厌氧罐，加入 1
包厌氧包（或厌氧产气袋），密封厌氧罐，确保罐内氧气被完全吸收（厌氧包变蓝表示厌氧环境达标）；
方法 2：将平板放入 CO培养箱，设置 CO浓度 5%-10%、温度
35-37（微需氧环境也可促进乳酸杆菌生长）。
培养时间：35-37培养 48-72
小时（乳酸杆菌生长较慢，培养时间不足会导致菌落过小、溶钙圈不明显，影响结果判读）。
步骤 4：结果观察与初步鉴别
菌落形态观察：培养结束后，取出平板，观察菌落形态（大小、颜色、边缘、表面质地）及是否存在
溶钙圈（乳酸杆菌产乳酸溶解 CaCO，形成透明圈）。
计数（可选）：选择菌落数在 30-300
之间的平板，统计乳酸杆菌菌落数（仅计数有溶钙圈的菌落），计算样品中乳酸杆菌的含量（CFU/g 或
CFU/mL）：
计算公式：乳酸杆菌含量（CFU/g）= 平板菌落数 × 稀释倍数 ×
10（因接种量为 0.1mL）。
革兰氏染色鉴定：
挑取典型菌落（有溶钙圈、乳白色黏稠菌落），涂片、固定后进行革兰氏染色；
显微镜下观察：乳酸杆菌为 革兰氏阳性杆菌（紫色），无芽孢、无鞭毛，多为单个或链状排列。
生化试验辅助鉴别：
过氧化氢酶试验：挑取菌落涂抹在载玻片上，滴加 1 滴 3%
HO，观察是否产生气泡（乳酸杆菌过氧化氢酶阴性，无气泡；杂菌多为阳性，产生气泡）；
糖发酵试验：将菌株接种到含葡萄糖、乳糖的发酵管中（添加酚红指示剂），37培养 24
小时，乳酸杆菌发酵糖类产酸不产气（培养基变为黄色，无气泡）。
步骤
5：纯培养分离（可选，用于获得单一菌株）
挑取典型的乳酸杆菌菌落（有溶钙圈、革兰氏阳性杆菌），用接种环在新的
MRS-CaCO平板上进行 划线分离（采用三区划线法，确保单菌落形成）；
35-37厌氧培养 48 小时，获得纯培养菌株，可用于后续鉴定或功能研究。
三、关键操作要点与质量控制
1、培养基质量控制
灭菌后需检查培养基是否澄清、有无沉淀（CaCO均匀分散为正常，若出现大量结块需重新制备）；
空白对照平板培养后应无菌落生长，否则说明培养基或器材灭菌不彻底；
阴性对照平板（如接种大肠杆菌）应无溶钙圈，且菌落生长受抑制（若大肠杆菌大量生长，说明培养基选择性不足，需调整 pH
或抑制成分浓度）。
2、操作过程质量控制
梯度稀释时，移液管需更换（或灭菌后使用），避免交叉污染；
涂布时涂布棒需冷却至室温（可在空白培养基边缘轻触验证，无 sizzle
声即可），避免高温杀死乳酸杆菌；
厌氧罐密封后需检查是否漏气（可在罐口涂抹肥皂水，无气泡溢出为密封良好）。
3、结果判读质量控制
溶钙圈不明显时，可延长培养时间至 72 小时，或用 pH
试纸检测菌落周围 pH（pH<5.5 为乳酸杆菌阳性）；
若平板上出现非典型菌落（无溶钙圈但革兰氏阳性），需结合生化试验排除杂菌（如芽孢杆菌、链球菌）；
计数时仅统计有溶钙圈的菌落，避免将杂菌计入。
四、总结
乳酸杆菌选择性培养基的实验流程核心是“无菌操作 + 精准配方 + 厌氧培养 +
多指标鉴别”，关键在于培养基
pH、抑制成分浓度和厌氧环境的控制。通过标准化步骤可实现乳酸杆菌的分离、计数与初步鉴别，为后续的菌种鉴定、功能验证奠定基础。若需获得高纯度菌株，需进一步进行划线分离和分子生物学鉴定。
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