细菌芽孢染色法的准备工作与核心步骤及操作流程与注意事项！
2026-02-03 15:09阅读：
细菌芽孢染色法的准备工作与核心步骤及操作流程与注意事项！
百欧博伟生物：细菌芽孢染色法的成功与否，很大程度上取决于操作细节的把控。由于芽孢结构特殊（壁厚、通透性低），且染色过程涉及加热等关键步骤，任何环节的疏漏都可能导致染色失败或结果误判。以下是详细的注意事项：
一、样本与培养物准备
1、选择合适的培养物龄
芽孢是细菌在不良环境下形成的休眠体，多在老龄培养物中大量产生（如芽孢杆菌属培养
24-48 小时，梭菌属需厌氧培养 3-5 天）。
避免使用幼龄菌（培养时间过短，芽孢未形成）或过度老化菌（芽孢可能脱落，仅见游离芽孢，难以观察与菌体的关系）。
2、确保样本中含芽孢
若为未知菌，需先通过普通染色（如革兰染色）初步判断是否可能形成芽孢（芽孢杆菌属、梭菌属多为革兰阳性菌），再进行芽孢染色，避免无效操作。
涂片时取菌量适中，过
多易导致细胞堆积，影响观察；过少则可能找不到芽孢。
二、涂片与固定
1、涂片均匀
用接种环取少量菌苔，与载玻片上的生理盐水（或蒸馏水）充分混匀，涂成薄而均匀的菌膜（面积约
1cm²），避免菌液过浓导致干燥后形成团块。
若直接取固体培养基上的菌，可省略生理盐水，直接用接种环蘸取少量菌在载玻片上涂开（因菌本身含少量水分）。
2、固定方式正确
待菌膜自然干燥后，通过火焰固定：将载玻片快速通过酒精灯外焰 3-4
次（以手背接触玻片不烫为宜），目的是杀死细菌、使菌体黏附在玻片上，同时避免高温破坏芽孢结构。
禁止在菌膜未干燥时直接加热，否则会导致菌体变形、脱落。
三、初染与加热控制（核心步骤）
1、染液选择与用量
常用初染液为5%
孔雀绿水溶液（穿透力强，与芽孢结合稳定），用量以覆盖菌膜为宜，过多易流淌，过少则易干涸。
2、加热温度与时间
加热是芽孢染色的关键：将载玻片放在石棉网上，用酒精灯外焰间接加热，使染液保持微沸状态（边缘轻微冒泡），持续
5-10 分钟。
严禁直接将玻片放在火焰上烧，或让染液剧烈沸腾（高温会破坏芽孢和菌体形态）。
加热过程中需不断补充染液（用滴管沿玻片边缘滴加），绝对避免菌膜干涸（干涸会导致染料沉淀，形成颗粒状杂质，干扰观察）。
3、冷却后再处理
加热结束后，先移去酒精灯，待玻片自然冷却至室温后再水洗，避免高温下突然水洗导致玻片炸裂。
四、脱色与复染
1、脱色充分但不过度
用自来水缓慢冲洗（水流不宜过急，避免冲掉菌膜），直至流出的水无色（约
1-2 分钟）。
脱色不足：营养体上残留初染液颜色，与芽孢颜色混淆，无法区分；
脱色过度：一般不会影响芽孢（因芽孢与染料结合牢固），但需注意水流强度，防止菌体被冲掉。
2、复染时间适中
复染目的是使营养体着色，常用0.5% 番红水溶液（或沙黄染液），染色时间
1-2 分钟即可。
复染时间过长：可能导致芽孢也被轻微复染，颜色对比度下降；
复染时间过短：营养体着色浅，与背景区分不明显。
五、水洗与干燥
1、水洗方向正确
水洗时应将玻片倾斜，让水流从玻片上方缓缓流过菌膜，避免垂直冲洗（冲击力过强）。
水洗后用吸水纸轻轻吸干（或让其自然干燥），禁止用力擦拭（防止擦掉菌膜）。
2、避免使用滤纸直接按压
若用吸水纸，应从边缘吸去水分，而非直接覆盖在菌膜上按压，防止染料颗粒残留或菌膜脱落。
六、镜检操作
1、物镜选择
先用低倍镜（10×）找到菌膜区域，再换高倍镜（40×）定位，最后用油镜（100×）观察细节（芽孢体积小，需油镜才能清晰分辨形态）。
2、区分芽孢与杂质
芽孢呈圆形或椭圆形，颜色均匀（如孔雀绿染色呈绿色），位于菌体内部（中央、顶端或近端）或游离于菌体之外；
染料沉淀常为不规则颗粒，颜色深浅不一，可通过调整焦距区分（芽孢在不同焦距下形态稳定，杂质易模糊）。
3、记录与判断
观察时需记录芽孢的形态（圆形 /
椭圆形）、大小（是否大于菌体直径）、位置（如破伤风梭菌芽孢位于顶端，呈“鼓槌状”），这些特征是细菌鉴定的重要依据。
七、安全与试剂管理
1、加热安全
加热时戴手套，避免染液溅到皮肤（孔雀绿为碱性染料，可能刺激皮肤）；使用三脚架或石棉网，防止玻片滑落。
2、试剂保存
孔雀绿染液需密封保存，避免蒸发浓缩；复染液易受光影响，需避光保存，定期更换（出现沉淀时不可使用）。
通过严格把控以上细节，可确保芽孢染色结果清晰：芽孢呈初染液颜色（如绿色），营养体呈复染液颜色（如红色），二者对比鲜明，为细菌的形态观察和分类鉴定提供可靠依据。
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