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微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的操作规程!

2026-02-24 15:48阅读:
微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的操作规程!





百欧博伟生物:微生物菌种冷冻干燥保藏是长期保存的首选方法(可保存数年至数十年),低温冷冻保藏(-20/-80)则更适合中短期保存或作为应急备份,两者核心都是通过低温和脱水降低微生物代谢活性,减少细胞损伤。

一、微生物菌种冷冻干燥保藏技术规程(长期保存)

冷冻干燥(冻干)通过“冻结 - 真空升华脱水”实现,关键是选择合适的保护剂、控制冻结速率和真空度,最大限度减少冰晶对细胞的破坏。

1、前期准备

菌种选择:需选择对数生长期的菌种,此时细胞活性高、抗逆性强。避免使用衰亡期菌种,否则存活率极低。

试剂与器具:

保护剂:根据菌种类型选择,常用配方如下表。

器具:冻干管(硬质玻璃,带密封塞)、移液管、培养皿、真空冷冻干燥机、超净工作台、高压灭菌锅。

器具灭菌:冻干管、移液管等需 121高压灭菌 20 分钟,烘干后备用;保护剂需过滤除菌(0.22μm 滤膜)或低压灭菌(115,15 分钟),避免高温破坏成分。

微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的操作规程!

2、菌悬液制备(超净工作台内操作)

取对数生长期的菌种,用无菌生理盐水或无菌培养基轻轻冲洗培养物,收集到无菌离心管中。

3000-5000rpm 离心 10-15 分钟,弃上清液,保留菌体沉淀。

向沉淀中加入适量保护剂,轻轻吹打混匀,制成10^8 - 10^9 CFU/mL的菌悬液(浓度过低会导致复苏困难)。

3、分装与预冻结

用无菌移液管将菌悬液分装到冻干管中,每管装 1-2mL(液面高度不超过管高的 1/3,便于升华)。

将冻干管放入-80冰箱或液氮罐(气相区,-150以下)预冻结 2-4 小时,确保菌悬液完全冻结(避免后续真空升华时出现沸腾,导致菌体流失)。

4、冷冻干燥(核心步骤)

将预冻结的冻干管连接到真空冷冻干燥机的样品架上,确保密封良好。

启动冻干机,先抽真空至10-30Pa,然后开启加热板(温度控制在 0-5,缓慢升温,避免冰晶快速融化)。

冻干过程持续 8-24 小时(根据菌悬液体积调整),直至冻干管内物质呈疏松的白色粉末状,无明显水分(可用重量法判断:冻干后重量稳定,不再下降)。

5、密封与保存

冻干结束后,在真空状态下用火焰熔封冻干管(或用无菌橡胶塞密封,外层套铝盖),确保无漏气。

标记冻干管:注明菌种名称、菌株编号、冻干日期、操作人员。

保存条件:4冰箱(短期,1-2 年)或-20冰箱(长期,5-10 年),避免反复冻融。

6、复苏与质量检测

复苏:用无菌镊子敲碎冻干管,加入 1-2mL 无菌培养基,轻轻吹打溶解冻干物,取 0.1-0.2mL 涂布平板或接种液体培养基,37(或菌种最适温度)培养 18-24 小时。

质量检测:

存活率:计数平板上的菌落数,计算复苏后的存活率(需≥50%,否则视为保藏失败)。

纯度:观察菌落形态,镜检确认无杂菌污染;必要时进行生化试验或分子鉴定,确保菌种未发生变异。

二、微生物菌种低温冷冻保藏技术规程(中短期保存)

低温冷冻保藏通过低温(-20/-80)直接抑制微生物代谢,操作简单、成本低,但保存时间较短(-20约 6-12 个月,-80约 1-3 年),需添加保护剂防止细胞结冰损伤。

1、适用范围

适合细菌、酵母菌、真菌菌丝体或孢子,不适合对低温敏感的极端微生物(如嗜热菌)。

2、前期准备

保护剂:首选15%-20% 甘油(细菌、酵母菌)或10%-15% 二甲基亚砜(DMSO)(真菌、动物细胞),需无菌处理(0.22μm 滤膜过滤)。

器具:无菌冷冻管(聚丙烯材质,耐低温)、移液管、超净工作台、-20/-80冰箱。

3、操作步骤(超净工作台内)

菌悬液制备:同冷冻干燥步骤,取对数生长期菌种,用无菌生理盐水离心收集菌体,加入无菌保护剂,制成 10^8 - 10^9 CFU/mL 的菌悬液。

分装:将菌悬液分装到无菌冷冻管中,每管 1-1.5mL,盖紧盖子并标记(菌种名称、编号、保藏日期)。

梯度降温(关键!减少冰晶损伤):

先将冷冻管放入4冰箱1 小时,让菌体适应低温。

转移至-20冰箱2-4 小时,使菌悬液缓慢冻结。

最终放入-80冰箱长期保存(若用 - 20冰箱,保存时间不超过 6 个月)。

(可选)若有程序降温仪,可设置“1/ 分钟”的降温速率,从 4降至 - 80,存活率更高。

4、复苏与注意事项

复苏:从 - 80冰箱取出冷冻管,立即放入37水浴锅中快速融化(1-2 分钟内完全融化,避免冰晶反复形成损伤细胞),然后按冻干复苏方法接种培养。

注意事项:

冷冻管取出后需一次性复苏完毕,禁止反复冻融(可分装多管,每次取 1 管使用)。

3-6 个月需抽样复苏检测,确认菌种活性和纯度,若存活率低于 30%,需重新制备保藏。

三、两种保藏技术对比

微生物菌种冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的操作规程!

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